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江苏生物制品内毒素检测结果判定
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发布时间：2025年10月16日
低内毒素回收（LER）又称内毒素掩蔽，是指无菌制剂（尤其蛋白类生物制剂）进行内毒素检测时，加标内毒素的回收率＜50% 的现象，且无法通过稀释排除，区别于传统检测干扰。LER 会导致内毒素污染被低估，已被全球监管机构重点关注：FDA 2013 年要求生物药 BLA 申报时提交 LER 研究报告；EMA 2023 年明确含表面活性剂（如吐温）或螯合剂（如 EDTA）的制剂需提供 LER 数据；中国药典 2025 版 9251 通则也新增 LER 内容，与国际接轨。这些要求促使企业优化内毒素检测流程，避免因 LER 导致的检测偏差，确保药品安全。
细菌内毒素检查有凝胶法和光度测定法，结果有争议时，除规定外以凝胶限度试验为准。江苏生物制品内毒素检测结果判定
内毒素检测的实验方案需遵循“标曲可靠性验证（灵敏度复核）-稀释倍数计算-干扰试验”的完整流程，以保障检测结果准确合规。首先进行标曲可靠性试验，用标准内毒素制备至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不超过10，下限浓度不低于鲎试剂标示检测限），每浓度设 3 支平行管，同时做2支阴性对照；当阴性对照的吸光度小于或透光率大于标准曲线下限的检测值或反应时间大于标准曲线下限的反应时间，对数据进行线性回归，相关系数r的幅值≥0.980时试验方有效，否则需重新操作。接着按公式 L=K/M 确定样本内毒素限值，K 值依给药途径而定，M结合人均60kg体重、1.62m² 体表面积及上限给药剂量计算，也可参考药典行标。随后明确有效稀释上限倍数（MVD），即供试品允许稀释的上限倍数，确保在此范围内检测限值。再开展样本干扰试验，制备供试品溶液（A）、供试品加标溶液（B，加标浓度为标曲中点）、标准曲线溶液（C）及阴性对照（D），按公式 R=(Cs-Ct)/λm×100%计算加标回收率，50%-200%为合格；若鲎试剂、生产工艺等发生变化，需重新进行干扰试验，保障内毒素检测的可靠性。
北京合规性内毒素检测合规申报70% 葡萄糖等高渗溶液会使鲎试剂蛋白变性，检测前需用检查用水稀释样本。
内毒素检测常与热原检测混淆，二者既有关联又有区别：热原是指所有能引起发热的物质（包括内毒素、病毒、真菌等），通过传统家兔热原试验检测；内毒素是热原的主要成分（占 90% 以上），检测更具特异性。目前，家兔热原试验因操作复杂、动物成本高，已逐渐被单核细胞活化反应测定法（MAT）替代，但部分产品（如放射性质药物、血液制品）仍需保留家兔试验作为补充。法规要求内毒素检测结果需与热原风险关联，若内毒素检测合格但临床出现热原反应，需排查是否存在非内毒素类热原，通过联合检测确保产品安全性。
在开展内毒素检测时，样品的 pH 值与二价离子（Mg²⁺、Ca²⁺）水平是影响鲎试剂酶促反应的关键因素，直接关系检测结果的准确性。鲎试剂检测内毒素依赖丝氨酸蛋白酶的级联放大反应，该反应的合适 pH 值范围为 6.0-8.0，若样品过酸或过碱，会快速降低酶活性，甚至导致酶彻底失活，进而出现内毒素检测假阴性。针对这一问题，可使用 0.1N 或更低浓度的 HCl/NaOH 溶液，将样品 pH 值准确调节至适宜区间，为反应提供稳定环境。同时，二价离子是反应必需的辅助因子：Mg²⁺是内毒素活化鲎试剂的关键，缺乏会直接阻断反应启动；Ca²⁺虽参与酶促反应，但浓度过高会反向抑制反应效率。若样品中含有肝素钠、EDTA、柠檬酸钠等螯合剂，会与二价离子结合导致其浓度不足，此时可通过内毒素检查用水稀释样品降低螯合剂浓度，或添加特定二价离子试剂补充，但需严格控制离子浓度，避免过度增强反应引发误差，确保内毒素检测能真实反映样品中的内毒素残留量。
重组级联试剂（rCR）无动物源，不含 G 因子，可避免 β- 葡聚糖致内毒素检测假阳性。
随着动物保护理念和法规要求升级，重组因子C法（rFC法）作为 LAL 法的替代技术逐渐普及。重组 C 因子是以基因重组的方式表达的 LAL 试剂中的 C 因子，C 因子被内毒素活化后切割荧光底物产生游离荧光基团，通过检测荧光信号可以反应活化后的蛋白酶活性，并由此可以推算出内毒素的含量。与传统 LAL 法相比，rFC 法无需依赖鲎血资源，避免了天然 LAL 试剂批间差异大、易受 β- 葡聚糖干扰等问题，且反应特异性更强。目前，《美国药典》、《欧洲药典》等法规已收录 rFC 法，欧盟更推荐其用于疫苗等高风险产品检测，在保证检测准确性的同时，符合动物福利和可持续发展要求。
内毒素检测复孔 CV＞15%，需校准移液枪，规范加样，排查耗材污染。北京合规性内毒素检测合规申报细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁脂多糖，细菌死亡裂解释放，微量级即致人体发热、休克等威胁。江苏生物制品内毒素检测结果判定
内毒素检测结果误差可能源于多环节：试剂方面，鲎试剂（LAL ）或试剂批间差异、过期试剂活性下降会导致结果偏差，需通过试剂验收（如阳性对照回收率验证）确保质量；操作方面，实验器具未除热原（如玻璃器皿未干热灭菌）、加样体积不准确会引入污染或误差，需严格执行 SOP（如器皿 250℃干热灭菌≥30 分钟）；环境方面，实验室空气中的微生物孢子、粉尘可能污染样品，需在洁净工作台操作并设置阴性对照。此外，反应温度波动（偏离 37℃±1℃）会影响酶活性，需使用恒温孵育器精确控温，确保反应条件稳定。
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