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江苏医疗器械热原检测单核细胞活化反应测定法
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发布时间：2025年11月14日
热原检测MAT法的法规地位持续提升，已成为多国药典认可的热原检测替代方法。欧洲药典（EP）是推动 MAT 应用的关键力量：通则 2.6.30 明确 MAT 可替代家兔热原试验（RPT），且能同时检测内毒素与非内毒素热原；2024 年欧洲药典委员会批准删除所有条款中的家兔法，修订文本将于 2025 年7月1日生效，强制鼓励使用 MAT 等体外替代方法。美国药典（USP）<151> 规定，经验证的体外热原试验（如 MAT）可替代家兔法，且需依据 USP<1225>开展验证；FDA 行业指南进一步明确 MAT 的合规性。中国药典 2020 年版通则 9301 将 MAT 列为热原检查的补充方法，虽暂未替代家兔法，但明确其适用于复杂基质样品的全热原筛查。此外，ISO 10993-1、ICCVAM 等国际标准也优先推荐体外热原检测模型，全球法规协同推动 MAT 成为热原检测的主流技术。
热原有广谱来源特征，革兰阴性菌（内毒素/LPS）致热能力强，革兰阳性菌、真菌、病毒均可产生。江苏医疗器械热原检测单核细胞活化反应测定法
MAT法热原检测中，标曲信号值偏低或线性不佳是常见问题，需按细胞、标准品、ELISA 检测三环节排查解决。细胞相关问题中，细胞复苏后若未充分混匀导致结团，种板后细胞分布不均，会使局部信号弱，需振荡细胞悬液后再种板；细胞活性差或处理时间超半小时，会降低炎症因子分泌，需严格按说明书操作并缩短处理时间；孵育未达 37℃、5% CO₂条件，细胞活化不足，需确保培养箱参数稳定；细胞悬液若接触外源热原，会引发非特异性反应，操作时需远离热原污染源。标准品问题方面，配制稀释错误会直接导致浓度不准，需核对稀释步骤；振荡时间不足（未按说明书要求）会使内毒素分散不均，需确保振荡充分且 4 小时内使用；标准品降解会导致效价下降，需按推荐条件保存（如 - 20℃冷冻）。ELISA 检测环节，孵育时间短或振荡速度慢会影响抗体结合，可适当延长孵育或提高振荡速度；TMB 显色不足（<3 分钟）会导致信号低，需显色 3-10 分钟，待高浓度点 OD600 达 1.0 时加终止液。
江苏医疗器械热原检测单核细胞活化反应测定法热原检测实验中，标准化培养基与恒定环境让单核细胞系活性稳定，避免PBMC冻存后的功能衰减。
MAT法（单核细胞活化反应测定）热原检测基于人体免疫反应机制设计，原理是：内毒素（革兰氏阴性菌来源）与非内毒素热原（革兰氏阳性菌、霉菌、病毒等来源）进入人体后，会活化单核细胞或单核细胞系，使其释放 IL-6、IL-1、IL-1β、TNF-α 等促炎细胞因子。检测时将供试品与单核细胞 / 单核细胞系共孵育，再通过 ELISA 定量检测释放的 IL-6 含量，结合内毒素标准品绘制的标曲，即可判断供试品中热原含量是否符合规定，实现内毒素与非内毒素热原的全覆盖检测。
PyroSHENTEK®热原检测试剂盒突破传统检测方法局限，不仅能检测革兰氏阴性菌来源的内毒素，还可准确识别革兰氏阳性菌（脂磷壁酸 LTA）、病毒、真菌等产生的非内毒素热原（NEP），契合热原检测 “全风险覆盖” 的法规需求。其定量限低至 0.025EU/mL，实验数据显示，对 Flagellin、LTA、Resiquimod、Poly-IC 等多种 NEP 均能有效检出，且加标回收率稳定在 50%-200% 合格范围（如贝伐珠单抗注射液中 LTA 加标回收率 66.8%、Zysoman 加标回收率 113%）。此外，试剂盒联合了国内相关机构完成室间验证，与传统家兔热原试验（RPT）桥接结果高度一致 —— 如人用狂犬病疫苗（Vero 细胞）中 LPS 加标回收率 152.1%、人血白蛋白中 LPS 加标回收率 71.6%，检测数据科学性符合国际法规要求，助力企业无缝衔接中美欧等地申报标准。
MAT热原检测通过热原活化单核细胞释放促炎细胞因子，再经ELISA定量 IL-6判断供试品是否合格。
PyroSHENTEK®热原检测试剂盒以 “简化流程、提升效率” 为设计理念，采用即用型细胞，冻存细胞无需离心复苏培养，复融后可直接与供试品混合共孵育，大幅节省传统细胞预处理（如调整细胞状态、铺板培养）的时间成本。实验流程清晰可控：只需按要求制备待测供试品与内毒素工作标准品，各取对应体积加入细胞悬液（每孔加样量明确），经 37℃、5% CO₂孵育 24 小时后，离心收集上清并通过 ELISA 法检测 IL-6 含量，全程可在 24 小时内获得稳定可靠的检测结果。这种便捷性尤其适配实验室高通量检测需求，减少人员操作步骤的同时，降低了因复杂操作引入的误差风险，兼顾效率与准确性。
热原检测历经动物整体试验、体外生化反应到细胞免疫应答的三阶段演进，灵敏度与效率不断提升。江苏医疗器械热原检测单核细胞活化反应测定法一旦热原涌入人体循环系统，致热因子直抵下丘脑体温中枢，导致调定点上移、产热升散热降，体温随之飙升。江苏医疗器械热原检测单核细胞活化反应测定法
MAT法热原检测中，非内毒素热原（NEP）对照品设为 “选做”，且试剂盒不默认配备，需结合检测需求灵活使用，背后有明确的设置逻辑。首先，试剂盒开发阶段已通过验证（用多种 NEP 配体刺激细胞），证明其可检出 NEP，后期实验是否加入 NEP 对照，只需根据内部管理要求或专业人员建议确定，无需强制设置；若产品产线明确无 NEP 污染风险（如只使用革兰氏阴性菌原料），可删除 NEP 对照，简化操作。其次，试剂盒不配备 NEP 对照品，是因不同用户需求差异大 —— 部分用户需检测特定 NEP（如脂磷壁酸），部分需检测广谱 NEP，因此提供单独购买选项，用户可按需选择，避免资源浪费。NEP 对照品的主要使用场景包括：一是方法验证阶段，用于确认试剂盒对 NEP 的响应性；二是产品工艺变更后，排查是否引入 NEP 污染；三是欧盟申报时，需证明方法可覆盖 NEP，此时需加入 NEP 对照品并显示阳性结果。若样品检测中 NEP 对照品阳性，而样品检测阴性，可排除 NEP 污染；若样品阳性，则需进一步鉴定热原类型。
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