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上海合规性热原检测欧盟出口方案
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发布时间：2025年11月06日
MAT法热原检测特定标准品与传统细菌内毒素国家标准品存在本质差异，需明确区分以保障检测准确性。MAT 特定标准品为大肠杆菌（E.coli 0113:H10:K）菌株制备，经全国 5 家药品检验所（含中检院）用凝胶法、动态浊度法及动态显色法协作标定，溯源至国际标准品，可同时检测内毒素与非内毒素热原；而传统细菌内毒素国家标准品（如 9000EU 规格）源自大肠杆菌（E.coli O111:B4），只适用于内毒素检测，无法识别非内毒素热原。关键验证数据显示，用 MAT法检测 9000EU 内毒素标准品时，加标回收率不在 50%-200% 的合格范围，因此不能替代 MAT 特定标准品。值得注意的是，尽管 MAT 试剂盒用内毒素标准品绘制标曲，但经验证其可识别非内毒素热原—若样品中存在非内毒素热原（如革兰氏阳性菌的脂磷壁酸），会触发细胞阳性反应，有效避免漏检，这也是 MAT 法在热原防控中优于单一内毒素检测的关键优势。
热原检测历经动物整体试验、体外生化反应到细胞免疫应答的三阶段演进，灵敏度与效率不断提升。上海合规性热原检测欧盟出口方案
一次合格的 MAT 法热原检测，需同时满足 “合格标曲” 与 “合格样品检测值及回收率” 两大关键条件。合格标曲需具备四要素：一是良好线性，采用 4-Parameter Logistic 拟合，R² 需接近 1.0，避免线性不佳导致定量偏差；二是良好信号值，各浓度点 OD 值需呈梯度变化，高浓度点 OD 值需足够（如上限浓度 OD600 达 1.0 左右），信号过低会影响灵敏度；三是良好 CV，复孔间 CV 需控制在合理范围（定量限内≤25%、定量上下限≤30%），确保重复性；四是良好背景值，阴性对照 OD 值需低于标曲下限浓度点 10%，排除外源污染。合格样品检测值则需满足加标回收率在 50%-200%，例如文档中某样品 10 倍稀释回收率 41.3%（不合格），20 倍 71.3%（接近合格），40 倍 97.7%（合格），需在 MVD 范围内调整稀释倍数，同时样品热原浓度需低于规定限值（CLC），方可判定样品符合要求。
江苏抗体药物热原检测规范2023年PRIMM研究：聚山梨酯80 mRNA疫苗中，家兔法热原检查因LER漏检41%，MAT回收率98%+。
PyroSHENTEK®热原检测试剂盒（MAT法）已完成 25 个品种样品的检测验证，覆盖单抗类、疫苗类、基因工程类、血液制品类、生化药品类与注射液，结果显示其适配性范围广但需关注部分样品的干扰。疫苗类（如麻腮风联合减毒活疫苗、人用狂犬病疫苗）、基因工程类（重组人促红素、干扰素 α-2b）、血液制品类（人血白蛋白、凝血因子 Ⅷ）与注射液（生理盐水、琥珀酰明胶）的加标回收率均在 50%-200% 范围内，无明显干扰，检测结果可靠。单抗类（如贝伐珠单抗、阿达木单抗）、中药注射液等样品虽存在不同程度的抑制作用，需通过提高稀释倍数（如稀释至 MVD 上限）、超声处理或添加中和剂消除抑制，优化后回收率均可达标。此外，MAT 法可有效检测非内毒素热原，如对贝伐珠单抗注射液中添加的酵母多糖（Zymosan，200μg/mL）、脂磷壁酸（LTA，10μg/mL），回收率分别达 113%、66.8%，证明其可解决传统鲎试剂漏检非内毒素热原的问题，尤其适用于高风险生物制品的热原防控。
随着发热反应分子机制研究的不断深化，单核细胞活化试验（MAT）作为一种体外热原检测技术，愈发受到医药与医疗器械行业的关注并逐步推广应用。该方法的原理是：让人体全血与待检样品中的热原充分接触后，通过检测体系中产生的 IL-1β、IL-6（因稳定性强、重复性优，常作为关键检测指标）、TNF 等促炎细胞因子含量，实现对热原污染程度的评估，整个过程能高度模拟人体先天免疫系统对热原的应答反应。相较于传统热原检测手段，MAT 的优势更为突出：不仅可检出各类热原污染物，包括尚未明确性质的未知热原，以及革兰氏阳性菌（脂磷壁酸）、真菌、病毒等产生的非内毒素热原，填补了传统内毒素检测（如鲎试剂法）的覆盖空白。此外，MAT 无需使用实验动物，契合全球 “替代、减少、优化”（3R 原则）的监管导向，目前已被《欧洲药典》等法规列为家兔热原试验的替代方法，进一步提升了其在合规检测中的适用性。
热原有广谱来源特征，革兰阴性菌（内毒素/LPS）致热能力强，革兰阳性菌、真菌、病毒均可产生。
MAT法热原检测中，获得标准 S 型标曲需通过显色时机控制与图形调整实现，确保标曲拟合准确。在显色时机控制上，加入 TMB 底物后，孔内颜色会逐渐变蓝，且随反应时间加深，当标准品浓度梯度呈现明显蓝色差异（如高浓度孔深蓝色、低浓度孔浅蓝色）时，即可加入终止液；若仪器含 600nm 波长，可在终止前检测高浓度标准品的 OD600nm 值，当达到 1.0 左右时终止，此时显色反应处于线性期，终止后颜色由蓝变黄，信号强度约增强 3 倍，易形成 S 型曲线。在图形调整上，若标曲拟合后未呈现明显 S 型，可通过调整坐标轴范围优化—如将纵轴（OD 值）范围设为 0-2.5，横轴（热原浓度）设为对数坐标，突出低浓度区的拐点与高浓度区的平台区，使曲线更接近 S 型。此外，标曲配制需确保浓度点单独配制（非连续稀释），避免高浓度标准品污染低浓度点，导致低浓度区信号异常升高，破坏 S 型曲线形态。通过以上方法，可有效提升 S 型标曲的成功率，保障热原定量的准确性。
一旦热原涌入人体循环系统，致热因子直抵下丘脑体温中枢，导致调定点上移、产热升散热降，体温随之飙升。江苏化学制药热原检测操作步骤热原检测采用人外周血单核细胞（PBMC），优势是天然受体谱系完整，但供体差异导致变异系数（CV）高达25%。上海合规性热原检测欧盟出口方案
MAT法热原检测中，样品与细胞共培养时长需严格控制，以保障炎症因子分泌量稳定。说明书要求共培养 24 小时，虽未明确允差，但实验验证显示，±30 分钟的允差对结果无明显影响 —— 细胞因子（如 IL-6）分泌具有时间依赖性，24 小时左右达到分泌平台期，半小时差异不会导致分泌量大幅波动。若实验室对结果稳定性要求极高（如 QC 放行检测），建议严格按 24 小时操作，避免因时长差异引入误差；若为预实验（如样品稀释倍数摸索），±30 分钟允差可接受，但需在记录中注明实际培养时长。需注意的是，共培养时长不可超过 26 小时或短于 22 小时：过长会导致细胞活性下降（炎症因子分泌减少），过短则未达分泌平台期（检测信号偏低），均可能导致热原浓度低估。此外，培养环境需保持稳定（37℃、5% CO₂），温度波动会影响细胞代谢，间接导致共培养时长的实际效果偏离，因此需定期校准培养箱温度，确保环境条件一致。
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