原料药热原检测技术服务
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发布时间:2025年10月22日
热原检测MAT法的法规地位持续提升,已成为多国药典认可的热原检测替代方法。欧洲药典(EP)是推动 MAT 应用的关键力量:通则 2.6.30 明确 MAT 可替代家兔热原试验(RPT),且能同时检测内毒素与非内毒素热原;2024 年欧洲药典委员会批准删除所有条款中的家兔法,修订文本将于 2025 年7月1日生效,强制鼓励使用 MAT 等体外替代方法。美国药典(USP)<151> 规定,经验证的体外热原试验(如 MAT)可替代家兔法,且需依据 USP<1225>开展验证;FDA 行业指南进一步明确 MAT 的合规性。中国药典 2020 年版通则 9301 将 MAT 列为热原检查的补充方法,虽暂未替代家兔法,但明确其适用于复杂基质样品的全热原筛查。此外,ISO 10993-1、ICCVAM 等国际标准也优先推荐体外热原检测模型,全球法规协同推动 MAT 成为热原检测的主流技术。
湖州申科 MAT法热原检测试剂盒细胞复融后可直接使用,无需离心复苏,24 小时内出检测结果。原料药热原检测技术服务
家兔热原试验作为热原检测领域的 “法定传统方法”,被中国药典(ChP)、美国药典(USP)、欧洲药典(EP)均列为法定检测项目,其主要优势在于可通过家兔体温应答筛查所有类型热原,尤其适用于无法排除非内毒素热原污染的高风险产品,如血液制品、放射性质药物及部分生物制剂。然而,家兔热原试验存在明显局限:动物个体差异大,需额外投入时间与成本筛选合格家兔;检测周期长(至少 6 小时),无法满足生物制品快速放行需求;灵敏度较低(对 LPS 检测限≥5EU/kg),与全球倡导的“动物福利3R原则”背道而驰。
原料药热原检测技术服务研究建立体外热原检测替代方法以替代家兔法,符合3R理论,是热原检测国际趋势,受各国药监机构重视。
热原检测技术自 20 世纪初问世以来,经历了 “动物试验→体外生化检测→细胞生物学检测” 的三次关键变革,每一次变革均推动检测效率、准确性与全面性的提升。20 世纪初至中期,热原检测方法只有家兔热原试验,通过观察家兔体温变化筛查热原,虽实现了广谱检测,但存在动物成本高、操作繁琐、灵敏度低、种属差异大等局限,难以满足制药行业快速发展需求。20 世纪 60 年代,鲎试验法(LAL 法)的发明开启了热原检测的 “体外生化时代”,利用鲎血变形细胞裂解物的凝血级联反应检测细菌内毒素,灵敏度提升至 ng 级,检测时间缩短至 1-2 小时,迅速成为制药行业常规质控方法;但该方法依赖鲎资源,易受 β- 葡聚糖干扰,且只能检测内毒素,无法覆盖非内毒素热原。21 世纪以来,重组技术与细胞生物学技术的发展推动热原检测进入 “全热原管控时代”:重组级联试剂(rCR)与重组 C 因子试剂(rFC)通过基因工程技术制备,摆脱对鲎资源的依赖,消除葡聚糖干扰,实现标准化生产;单核细胞活化反应测定(MAT)利用人源单核细胞检测全类型热原,填补非内毒素热原检测空白,且结果更贴近人体实际反应。
MAT法热原检测中,ELISA 加终止液后的读数时间需严格控制,以保障 IL-6 检测信号稳定。湖州申科生物MAT试剂盒说明书明确要求,终止液添加后需在 10 分钟内完成读数,且需避光操作 —— 原因在于,终止液(如硫酸)会终止 TMB 显色反应,但生成的黄色产物在光照下易降解,超过 10 分钟后 OD 值会下降,导致 IL-6 检测值偏低。读数前需进行 30 秒震荡混匀,确保孔内液体浓度均匀,避免因局部浓度差异导致复孔 OD 值波动。酶标仪波长需设置为 450nm,若仪器含 600nm 参考波长,可同时检测 600nm 波长以扣除背景干扰(如细胞碎片导致的光散射),提升检测准确性。需注意的是,读数时不可覆盖封板膜或盖子,避免膜上凝结的水蒸气滴入孔中,导致 OD 值异常升高。若因仪器故障无法及时读数,需将微孔板密封后置于 4℃避光保存,并在 30 分钟内完成读数,同时在记录中注明延迟原因,评估延迟对结果的影响(如延迟 20 分钟,OD 值可能下降 15%,需校正后使用)。
2023年PRIMM研究:聚山梨酯80 mRNA疫苗中,家兔法热原检查因LER漏检41%,MAT回收率98%+。
在单核细胞活化试验(MAT)的热原检测中,IL-6 被确定为关键检测指标,而非 IL-1β 或 TNF-α,主要源于其在稳定性、生物学关联性及商业化应用上的优势。从稳定性来看,IL-6 在体外培养环境中受个体免疫状态影响较小,半衰期更长,实验重复性更优,且检测灵敏度高,能准确定量热原污染水平;而 TNF-α 和 IL-1β 产生时间短、表达量低,还易被蛋白酶降解,导致检测信号波动大,难以标准化。从生物学特性而言,IL-6 是先天免疫反应的炎症介质,可通过活化 JAK-STAT 和 NF-κB 通路驱动急性期反应,如诱导大脑产生前列腺素 E2(PGE2)触发发热,与热原的致热机制直接关联,是公认的发热标志物。同时,MAT 法热原检测会辅以 IL-1β 和 TNF-α 监测 ——IL-1β 反映单核细胞活化程度,TNF-α 提示炎症放大效应,形成多因子协同体系。此外,IL-6 的 ELISA 试剂盒市场成熟度高、跨平台兼容性强,而 IL-1β 和 TNF-α 的检测方法在灵敏度和标准化上仍有局限,进一步奠定了 IL-6 的重要地位。
单核细胞系传代可控,20代以内TLR表达与炎症因子分泌保持稳定,确保热原响应一致性。原料药热原检测技术服务
细胞因子IL-6因稳定性高、半衰期长,被选为热原检测MAT法关键定量指标,优于TNF-α与IL-1β。原料药热原检测技术服务
MAT 法热原检测的稳定性需从细胞、试剂、操作、样品四维度严格把控。细胞层面,细胞活性与纯度直接决定热原响应能力,活性不足会减少炎症因子分泌,纯度低则引入杂细胞干扰;细胞批次间一致性也关键,TLR 受体表达、倍增时间差异会导致结果波动。试剂与耗材方面,标准品效价需溯源国际标准,避免降解影响标曲;试剂盒中细胞因子需质控,防止外源热原污染;培养液、缓冲液及无热原耗材(吸头、西林瓶)若热原控制不当,易引发假阳性。操作上,加样手法要统一(如 8 通道移液器液面一致),孵育需 37℃、5% CO₂稳定环境,试剂配制浓度准确,设备(酶标仪、洗板机)定期校准,操作偏差会直接导致异常。样品层面,自身干扰物质(消除炎症成分、高盐)、pH 偏离 6-8 或微生物污染,会抑制细胞活化或引入外源热原,需针对性预处理。
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