动态光散射通过测量溶液中蛋白质分子布朗运动引起的激光散射光波动来估算其流体力学半径分布。在纯化中,DLS可用于快速评估样品单分散性:一个单分散的峰表明蛋白质处于均一、未聚集的状态,这对于结构生物学研究...
在整个纯化过程中,必须对每一步的产物进行快速分析,以评估纯化效果。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是较常用的分析技术,它通过使蛋白质在电场中按分子量大小迁移,经染色后呈现条带,直观显示样品中蛋白质的组成和纯...
一个高效的纯化工艺不是一蹴而就的,而是通过系统性的开发和优化过程建立的。它始于对目标蛋白性质和纯化目标的深入理解。接着是“筛选”阶段:使用微量形式(如96孔板格式的层析树脂)快速测试多种层析方法(IE...
为了加速药物发现和工艺开发,高通量和自动化液体处理工作站被广泛应用于蛋白质纯化。这些系统可以并行地进行数十甚至上百个微型化的纯化实验,例如:同时测试不同的表达条件、裂解方法、或层析条件(不同树脂、缓冲...
层析技术是现代蛋白质纯化的支柱,其主要原理是利用蛋白质在固定相(层析介质)和流动相(缓冲液)之间分配的差异,因理化性质不同而产生迁移速率差,从而实现分离。固定相被填充在层析柱中,当蛋白质混合物随流动相...
在获得澄清的细胞提取液后,第一步纯化(常称为粗提或富集)常采用沉淀法。其原理是通过改变溶液条件,大幅降低目标蛋白(或杂蛋白)的溶解度,使其选择性沉淀,从而实现与大量杂质的快速分离。经典的方法是硫酸铵沉...
从实验室级别(毫克级)的工艺开发到工业生产(克/千克级)的放大,并非简单的几何尺寸放大,而是一个复杂的工程学挑战。放大过程中,流体动力学参数会发生改变。维持线性流速和柱床高度不变是常见策略,但柱直径的...
动态光散射是一种快速、无损的技术,用于测量溶液中蛋白质或纳米颗粒的流体力学半径分布。在蛋白质纯化中,DLS主要用于:1)评估样品的单分散性,一个狭窄的峰表明样品均一,是结晶和结构研究的理想状态;一个宽...
在大肠杆菌等系统中表达重组蛋白时,一个常见的问题是目标蛋白可能以不溶性的、无活性的聚集体的形式表达,称为“包涵体”。虽然这带来了挑战,但包涵体通常很纯净,且能抵抗蛋白酶降解。纯化包涵体蛋白的策略与可溶...
外泌体等细胞外囊泡的纯化是当前研究热点。由于其尺寸小、密度低,常用方法包括差速超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱以及基于特定膜蛋白的免疫亲和捕获。这些方法旨在从复杂的生物体液中分离出高纯度的囊泡,同...
盐析法是蛋白粗提的经典技术,基于“盐溶与盐析”原理实现蛋白分离。蛋白质在低盐浓度溶液中溶解度随盐浓度升高而增加(盐溶),当盐浓度达到一定阈值后,溶解度反而下降并析出(盐析)。常用盐类为硫酸铵,因其溶解...
连续层析是生物制药下游工艺的新趋势,它通过多柱切换技术,使层析过程在不同阶段(如上样、洗淋、洗脱、再生)同时进行,提高了介质利用率和生产效率,减少了设备占地面积和缓冲液消耗。这种模式在抗体的大规模生产...
对于小规模筛选或常规纯化,使用市售的预装层析柱非常方便。而对于特定介质或规格需求,实验室也可以利用空柱管和筛板自行装填小型预装柱。这种自制柱提供了极大的灵活性,允许研究人员快速测试不同介质,且成本较低...
纯化之旅始于对原料的明智选择。常见的起始物料包括细菌(如大肠杆菌)、酵母、昆虫或哺乳动物细胞等重组表达系统,以及动物组织(如肝脏)、植物材料或血清等天然来源。选择依据主要取决于目标蛋白的性质、表达量、...
蛋白分离纯化的基本原则遵循“分步分级、逐步富集”,主要依据是蛋白质与杂质在物理化学性质上的差异。这些差异包括分子大小、溶解度、电荷性质、疏水性、生物亲和力等,不同分离技术分别针对某一特定性质实现分离。...
除非纯化的是胞外分泌的蛋白质,否则第一步通常是从细胞或组织中释放出目标蛋白。细胞破碎的方法需根据样本类型选择。对于细菌,常用超声破碎、高压匀质(如French Press)或酶解法(如溶菌酶处理)。对...
在获得澄清的细胞提取液后,第一步纯化(常称为粗提或富集)常采用沉淀法。其原理是通过改变溶液条件,大幅降低目标蛋白(或杂蛋白)的溶解度,使其选择性沉淀,从而实现与大量杂质的快速分离。经典的方法是硫酸铵沉...
盐析法是蛋白粗提的经典技术,基于“盐溶与盐析”原理实现蛋白分离。蛋白质在低盐浓度溶液中溶解度随盐浓度升高而增加(盐溶),当盐浓度达到一定阈值后,溶解度反而下降并析出(盐析)。常用盐类为硫酸铵,因其溶解...
膜蛋白嵌入或附着于生物膜中,其分离纯化比可溶性蛋白更为复杂。首要挑战是增溶:必须使用去垢剂(如TritonX-100,DDM,CHAPS)来替代膜脂质,将膜蛋白从其天然环境中“撬”出来,形成可溶的蛋白...
现代蛋白质纯化,尤其是对于研究用途的重组蛋白,极大地受益于基因工程技术的应用。通过在目标蛋白的基因序列中引入一段编码特定“标签”的序列,可以在蛋白质的N端或C端融合表达一个额外的多肽或蛋白质。这些标签...
外泌体等细胞外囊泡的纯化是当前研究热点。由于其尺寸小、密度低,常用方法包括差速超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱以及基于特定膜蛋白的免疫亲和捕获。这些方法旨在从复杂的生物体液中分离出高纯度的囊泡,同...
在整个纯化流程中,实时监测每一步的纯化效果至关重要。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是较常用、较直观的工具。它能在变性条件下根据分子量大小分离蛋白质,通过考马斯亮蓝或银染染色,可...
除了常用的组氨酸标签和Protein A,开发新型亲和配体是一个活跃的研究领域。这包括:1)开发小分子仿生配体,模拟天然配体的结构,但具有更好的稳定性和更温和的洗脱条件;2)使用核酸适配体(Aptam...
虽然SPR本身不是一种纯化技术,但它在纯化工艺开发,特别是亲和层析的开发和优化中扮演着关键角色。SPR能够实时、无标记地测量生物分子间(如抗原-抗体、受体-配体)的相互作用动力学,即结合速率常数(ka...
连续层析是生物制药下游工艺的新趋势,它通过多柱切换技术,使层析过程在不同阶段(如上样、洗淋、洗脱、再生)同时进行,提高了介质利用率和生产效率,减少了设备占地面积和缓冲液消耗。这种模式在抗体的大规模生产...
虽然SPR本身不是一种纯化技术,但它在纯化工艺开发,特别是亲和层析的开发和优化中扮演着关键角色。SPR能够实时、无标记地测量生物分子间(如抗原-抗体、受体-配体)的相互作用动力学,即结合速率常数(ka...
在离心之后,上清液可能仍含有细微的悬浮颗粒和脂质,这些杂质会堵塞后续的层析柱,明显降低纯化效率。深层过滤作为一种补充的澄清手段,利用由纤维素、硅藻土等组成的具有深度效应的滤膜,通过机械截留和吸附作用捕...
成功运行一次层析需要细致的操作和优化。关键步骤包括:柱平衡,用起始缓冲液冲洗柱子直至pH和电导稳定,确保固定相处于正确的结合状态;上样,样品应与平衡缓冲液的成分尽可能一致,通常需要提前透析或使用脱盐柱...
膜蛋白嵌于脂质双分子层中,具有疏水表面,使其在水溶液中极易聚集和沉淀,纯化难度远大于可溶性蛋白。关键技术在于使用温和的去垢剂(如DDM、Triton X-100)将其从膜中“溶解”出来,并在整个纯化过...
纯化之旅始于对原料的明智选择。常见的起始物料包括细菌(如大肠杆菌)、酵母、昆虫或哺乳动物细胞等重组表达系统,以及动物组织(如肝脏)、植物材料或血清等天然来源。选择依据主要取决于目标蛋白的性质、表达量、...