从实验室级别(毫克级)的工艺开发到工业生产(克/千克级)的放大,并非简单的几何尺寸放大,而是一个复杂的工程学挑战。放大过程中,流体动力学参数会发生改变。维持线性流速和柱床高度不变是常见策略,但柱直径的...
在工业生产和大型研究项目中,纯化成本是需要严格考量的因素。成本包括层析介质(其寿命和载量)、缓冲液、设备折旧、人力及时间。一个高质量的纯化流程不仅追求高纯度,还需在成本、时间和收率之间取得比较好平衡,...
质谱(MS)已成为蛋白质纯化过程中不可或缺的分析工具。其应用包括:1)鉴定纯化产物,通过肽质量指纹图谱(PMF)或液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)确认目标蛋白的身份,并检测是否存在截短或修饰形式...
膜过滤根据孔径大小和分离机制的不同,在纯化流程的不同阶段发挥着多种作用。微滤(0.1-10 μm)用于澄清,去除细胞碎片和大的颗粒物。超滤(UF)是依据分子量截留(MWCO, 通常1-1000 kDa...
膜蛋白嵌入或附着于生物膜中,其分离纯化比可溶性蛋白更为复杂。首要挑战是增溶:必须使用去垢剂(如TritonX-100,DDM,CHAPS)来替代膜脂质,将膜蛋白从其天然环境中“撬”出来,形成可溶的蛋白...
膜过滤根据孔径大小和分离机制的不同,在纯化流程的不同阶段发挥着多种作用。微滤(0.1-10 μm)用于澄清,去除细胞碎片和大的颗粒物。超滤(UF)是依据分子量截留(MWCO, 通常1-1000 kDa...
动态光散射通过测量溶液中蛋白质分子布朗运动引起的激光散射光波动来估算其流体力学半径分布。在纯化中,DLS可用于快速评估样品单分散性:一个单分散的峰表明蛋白质处于均一、未聚集的状态,这对于结构生物学研究...
一个高效的纯化方案绝非层析方法的随机堆砌,而是基于不同分离原理的科学组合。典型的策略遵循“捕获-中间纯化-精纯”的三步法逻辑。捕获阶段(如亲和层析)旨在快速富集目标物;中间纯化(如离子交换、疏水层析)...
蛋白质分离纯化的根本目的在于从复杂的生物样本(如细胞、组织或培养液)中,特异性地获得高纯度、具有生物活性的单一蛋白质。这一过程绝非简单的分离,而是对生命功能执行者——蛋白质的精密提纯与鉴定。其意义深远...
细胞破碎后,混合物中包含可溶性蛋白质、核酸、细胞器碎片及完整的细胞壁等不溶物。离心是分离这些组分较常用且高效的方法。通过施加强大的离心力,密度较大的颗粒(如细胞碎片、细胞核)会快速沉降形成沉淀,而可溶...
虽然电泳(如SDS-PAGE, 等电聚焦, 天然PAGE)主要用于分析,但它们也可用于小规模的制备或特殊用途的纯化。制备型电泳可以在非变性条件下分离蛋白质,用于后续的活性研究或抗原制备。电洗脱是从凝胶...
在大肠杆菌等系统中表达重组蛋白时,一个常见的问题是目标蛋白可能以不溶性的、无活性的聚集体的形式表达,称为“包涵体”。虽然这带来了挑战,但包涵体通常很纯净,且能抵抗蛋白酶降解。纯化包涵体蛋白的策略与可溶...
在现代自动化纯化系统中,集成多种在线检测器可以实时监控纯化进程。除了基本的紫外检测器,还包括在线电导率仪监测盐浓度、在线pH计监测酸碱度,甚至在线光散射和DLS检测器,能够实时判断样品单分散性和检测聚...
固定化金属离子亲和层析是重组蛋白纯化中较广泛应用的技术之一。其原理是将螯合剂固定于介质上,螯合镍离子、钴离子等过渡金属离子,这些金属离子又能与重组蛋白末端融合的寡聚组氨酸标签(如6xHis标签)特异性...
等电点沉淀是一种基于蛋白质在pH等于其等电点时净电荷为零、溶解度比较低的原理进行的粗分离方法。通过调节样品溶液的pH,可以使一类等电点相近的蛋白质或杂质沉淀出来,从而实现初步的富集或去除。该方法简单、...
亲和层析是所有层析方法中通常能提供比较高纯度和富集倍数的一步。其原理是利用目标蛋白与固定相上配体之间高度特异性的、可逆的生物化学相互作用。较经典的例子是固定化金属离子亲和层析(IMAC),用于纯化带有...
现代蛋白质纯化,尤其是对于研究用途的重组蛋白,极大地受益于基因工程技术的应用。通过在目标蛋白的基因序列中引入一段编码特定“标签”的序列,可以在蛋白质的N端或C端融合表达一个额外的多肽或蛋白质。这些标签...
膜蛋白嵌入或附着于生物膜中,其分离纯化比可溶性蛋白更为复杂。首要挑战是增溶:必须使用去垢剂(如TritonX-100,DDM,CHAPS)来替代膜脂质,将膜蛋白从其天然环境中“撬”出来,形成可溶的蛋白...
准确测定蛋白质浓度是纯化过程中定量分析的基础。它用于计算回收率、比活性以及为后续实验准备准确剂量的样品。有多种方法可供选择,各有优缺点。Bradford法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料的结合,快...
一个高效的纯化方案绝非层析方法的随机堆砌,而是基于不同分离原理的科学组合。典型的策略遵循“捕获-中间纯化-精纯”的三步法逻辑。捕获阶段(如亲和层析)旨在快速富集目标物;中间纯化(如离子交换、疏水层析)...
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在不使用SDS和还原剂的情况下进行,蛋白质的迁移速率取决于其自身电荷、大小和形状。它能保留蛋白质的天然结构和生物活性。结合活性染色,例如在凝胶中直接检测酶促反应,可以在电泳后直...
除非纯化的是胞外分泌的蛋白质,否则第一步通常是从细胞或组织中释放出目标蛋白。细胞破碎的方法需根据样本类型选择。对于细菌,常用超声破碎、高压匀质(如French Press)或酶解法(如溶菌酶处理)。对...
除了常用的组氨酸标签和Protein A,开发新型亲和配体是一个活跃的研究领域。这包括:1)开发小分子仿生配体,模拟天然配体的结构,但具有更好的稳定性和更温和的洗脱条件;2)使用核酸适配体(Aptam...
在整个纯化过程中,必须对每一步的产物进行快速分析,以评估纯化效果。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是较常用的分析技术,它通过使蛋白质在电场中按分子量大小迁移,经染色后呈现条带,直观显示样品中蛋白质的组成和纯...
离子交换层析是根据蛋白质表面净电荷的不同进行分离的强有力工具。固定相是带有电荷的基团:阴离子交换剂带正电(如DEAE, Q),结合带负电的蛋白质;阳离子交换剂带负电(如CM, SP),结合带正电的蛋白...
这两种层析都基于蛋白质的疏水性质,但应用条件和剧烈程度不同。HIC在生理条件或高盐浓度下进行,高盐浓度增强了蛋白质表面的疏水相互作用,使其与固定相上温和的疏水基团(如苯基、丁基)结合。随后通过降低盐浓...
固定化金属离子亲和层析是重组蛋白纯化中较广泛应用的技术之一。其原理是将螯合剂固定于介质上,螯合镍离子、钴离子等过渡金属离子,这些金属离子又能与重组蛋白末端融合的寡聚组氨酸标签(如6xHis标签)特异性...
在纯化过程中,目标蛋白可能被内源或外源的蛋白酶降解,导致产量低下、条带模糊或活性丧失。控制蛋白酶污染是一个系统性工程。预防措施包括:全程在低温(0-4°C)下操作;在裂解缓冲液和所有纯化缓冲液中添加广...
金属螯合亲和层析(IMAC)是重组蛋白纯化中较常用的亲和技术,利用His标签与二价金属离子(Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺)的特异性结合实现分离。树脂表面偶联亚氨基二乙酸(IDA)或 nitrilotr...
从实验室级别(毫克级)的工艺开发到工业生产(克/千克级)的放大,并非简单的几何尺寸放大,而是一个复杂的工程学挑战。放大过程中,流体动力学参数会发生改变。维持线性流速和柱床高度不变是常见策略,但柱直径的...