细胞的固定及免疫荧光：吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向孔内滴加足够量适宜浓度的二抗，37℃，室温避光孵育1小时。注意二抗带有荧光素标记，因此操作过程尽量在暗处进行。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst复染细胞核，一般为蓝色荧光；避光孵育5-10min。使用PBS轻洗细胞3 次，每次 5 min，洗去多余的DAPI。取爬片时由于爬片与培养皿底结合较紧，张力较大，可将注射器针头针尖向背面做个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出即可。用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，注意将爬片反过来贴于多聚赖氨酸载...

检测复杂的生物学结构需要较高清晰度的荧光信号，并将荧光信号从背景噪声中分离开来。标准的免疫荧光标记很少能够获得较佳信噪比的成像效果。获得良好图片和较佳的可供发表的高质量图像之间的差异就在于：需要精细调整样品信号达到峰值特异性、高清晰度和较佳放大倍数。虽然荧光基团是进行高质量细胞成像的较佳选择，但不可避免地也极易发生光漂白，即荧光信号的光化学降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能导致数据出现偏差，产生假性结果。抗淬灭封片剂可以保护荧光标记蛋白的稳定性，维持数周乃至数月的图像信号完整度。免疫荧光在医学诊断中起着重要作用，可以用于检测病原体、肉瘤标志物等。JNK免疫免疫荧光实验的注意事项：对荧光标记的...

细胞的固定及免疫荧光：吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向孔内滴加足够量适宜浓度的二抗，37℃，室温避光孵育1小时。注意二抗带有荧光素标记，因此操作过程尽量在暗处进行。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst复染细胞核，一般为蓝色荧光；避光孵育5-10min。使用PBS轻洗细胞3 次，每次 5 min，洗去多余的DAPI。取爬片时由于爬片与培养皿底结合较紧，张力较大，可将注射器针头针尖向背面做个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出即可。用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，注意将爬片反过来贴于多聚赖氨酸载...

荧光素标记抗体的方法：方法及步骤：①抗体的准备：取适量已知球蛋白浓度之溶液，置入三角烧瓶中，加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使然后蛋白浓度为20mg/ml，缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5～10min。②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末。③结合（或称标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约5～10min内加完），加毕后，继续搅拌12～18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右，故须及时添冰去水；亦可将结...

细胞免疫荧光简单实验步骤如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小时。2. -20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟。3. PBS洗净：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗净：2×5 min。6. 羊血清封闭：37度，20分钟。7. 一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度，1-2小时。8. 4度PBS洗净，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小时。10. 37度 PBS洗净，3×5 min。11. 凉干封片（封闭液PH8.5）；不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时...

免疫荧光实验步骤：1.样本准备：细胞或薄组织。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。2.固定：取适当的固定剂固定样本。一般用4%PFA固定4℃过夜。固定完毕后的样本可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。3.洗涤：PBS洗涤5min*3次。4.打孔：选择合适的通透剂处理样本，目的是使抗体更容易进入细胞与抗原结合。免疫荧光技术可以用于研究遗传疾病和基因表达调控。CD68免疫组化免疫荧光...

免疫荧光Coons等于1941年初次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。免疫荧光技术可以用于研究疾病的...

直接免疫荧光：单抗体（一抗）用于免疫染色和检测目标蛋白。荧光素结合的一抗直接与目标抗原结合，并使用成像显微镜观察。直接免疫荧光的优点：由于无需为两种抗体选择不同的物种反应性，从而降低了物种交叉反应性问题。与间接免疫荧光相比，时间缩短（操作步骤减少）。直接免疫荧光的缺点：不允许通过二抗进行信号放大；检测灵敏度降低；荧光素结合一抗的选择有限；与使用荧光二抗的检测相比，更昂贵。间接免疫荧光：使用两种抗体（一抗和二抗）进行免疫染色并检测目标蛋白。首先，用特异性一抗标记目标蛋白。然后，荧光素结合的二抗（与一抗具有不同的物种反应性）识别结合的抗原-抗体复合物并与一抗结合。由于一个以上的二抗可以与一抗结合，...

检测复杂的生物学结构需要较高清晰度的荧光信号，并将荧光信号从背景噪声中分离开来。标准的免疫荧光标记很少能够获得较佳信噪比的成像效果。获得良好图片和较佳的可供发表的高质量图像之间的差异就在于：需要精细调整样品信号达到峰值特异性、高清晰度和较佳放大倍数。虽然荧光基团是进行高质量细胞成像的较佳选择，但不可避免地也极易发生光漂白，即荧光信号的光化学降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能导致数据出现偏差，产生假性结果。抗淬灭封片剂可以保护荧光标记蛋白的稳定性，维持数周乃至数月的图像信号完整度。使用荧光抗体方法是免疫荧光技术中常见的操作步骤。NF200免疫荧光试验免疫荧光技术的主要特点是：特异性强、敏感性高...

荧光色素：异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，较大吸收光波长为490495nm，较大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用较普遍的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。四乙基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性质稳定，可长期保存。结构式如下：较大吸收光波长为570nm，较...

免疫荧光通过抗体与示踪物质结合，利用抗原-抗体结合反应，进而对抗原所在的细胞或组织进行定性或定量。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，可以看见荧光所在的细胞或组织，利用定量技术测定含量，从而可对抗原进行细胞定性和定位分析。细胞免疫荧光用途：快速直观显示所检测蛋白的细胞定位。材料与仪器：样品：贴壁细胞；试剂：4% 组织固定液，PBS，Triton X-100，BSA，荧光二抗，免疫荧光染色二抗稀释液，抗荧光猝灭封片液，0.25% 胰酶；器材：6/12/24 孔板，细胞爬片（盖玻片），载玻片，15 ml 离心管。荧光抗体法和荧光抗原法都属于免疫荧光技术的...

细胞免疫荧光实验注意事项：根据所检测抗原所在位置来确认是否需要加入 Triton 进行通透。若所检测抗原表位位于膜蛋白的白外段，则不需要通透；一般 5% BSA 封闭即可达到效果；从加荧光二抗起，后面所有操作步骤尽量避光。缩短在荧光显微镜下的观察时间，1~2 h 为宜。染色后尽快荧光显微镜下观察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。无/弱染色：烤片温度过高，推荐 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否适用固定液和石蜡切片，使用浓度是否过低，孵育是否时间过短等。免疫荧光技术可以用于研究遗传疾病和基因表达调控。X Hu Nuclei免疫荧光IF免疫荧光应用范围：其应用范围极其普遍，可以测定内分泌...

免疫荧光法是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术。免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原...

细胞免疫荧光实验注意事项：非特异性染色：是否灭活内源性过氧化物酶；孵育过程中干片；抗原热修复过度。染色过深：一抗浓度过高；染色试浓度过高或孵育时间过长；染色剂浓度过高或孵育时间过长。通常实验室先固定细胞再进行通透，但若检测抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，这样可以通过通透去除一些水溶性蛋白，进而可降低免疫荧光背景和非特异性信号；建议设阴性对照组，消除由于抗体非特异性结合而产生的背景染色；选择醛类固定液时，保持其新鲜度，较好现配现用，使用不新鲜的醛类固定液自发荧光背景会升高。荧光抗原法是利用已知的荧光标记物来追踪或检查相应抗体的方法。Tyrosine Hydroxylase(TH)免疫免疫荧光...

细胞免疫荧光实验注意事项：非特异性染色：是否灭活内源性过氧化物酶；孵育过程中干片；抗原热修复过度。染色过深：一抗浓度过高；染色试浓度过高或孵育时间过长；染色剂浓度过高或孵育时间过长。通常实验室先固定细胞再进行通透，但若检测抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，这样可以通过通透去除一些水溶性蛋白，进而可降低免疫荧光背景和非特异性信号；建议设阴性对照组，消除由于抗体非特异性结合而产生的背景染色；选择醛类固定液时，保持其新鲜度，较好现配现用，使用不新鲜的醛类固定液自发荧光背景会升高。免疫荧光技术可以用于研究细胞分裂和细胞周期。AIRE-1免疫抗体免疫荧光检测相对于酶检测的优势：定量荧光信号的能力（与使...

免疫荧光的制作：样品准备（贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等）：对于贴壁细胞：先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理，然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中，用无菌PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片，操作小心，防止细胞脱片。对于悬浮细胞：有2种方法，①先在悬浮液中进行固定步骤，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。②先在悬浮液中进行固定和染色步骤，离心洗脱，然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。对于石蜡切片：免疫荧光中石蜡切片较少，要先进行脱蜡和抗原修复处理。免疫荧光技术具有高灵敏度和高特异性，可以...

免疫荧光实验的注意事项：为了保证荧光染色的正确性，初次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。①标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。②特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。③阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本较好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。免疫荧光技术可以通过荧光信号显示和检查细胞或组织内的抗原或半抗原物...

细胞免疫荧光简单实验步骤如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小时。2. -20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟。3. PBS洗净：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗净：2×5 min。6. 羊血清封闭：37度，20分钟。7. 一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度，1-2小时。8. 4度PBS洗净，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小时。10. 37度 PBS洗净，3×5 min。11. 凉干封片（封闭液PH8.5）；不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时...

直接免疫荧光：单抗体（一抗）用于免疫染色和检测目标蛋白。荧光素结合的一抗直接与目标抗原结合，并使用成像显微镜观察。直接免疫荧光的优点：由于无需为两种抗体选择不同的物种反应性，从而降低了物种交叉反应性问题。与间接免疫荧光相比，时间缩短（操作步骤减少）。直接免疫荧光的缺点：不允许通过二抗进行信号放大；检测灵敏度降低；荧光素结合一抗的选择有限；与使用荧光二抗的检测相比，更昂贵。间接免疫荧光：使用两种抗体（一抗和二抗）进行免疫染色并检测目标蛋白。首先，用特异性一抗标记目标蛋白。然后，荧光素结合的二抗（与一抗具有不同的物种反应性）识别结合的抗原-抗体复合物并与一抗结合。由于一个以上的二抗可以与一抗结合，...

细胞免疫荧光简单实验步骤如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小时。2. -20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟。3. PBS洗净：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗净：2×5 min。6. 羊血清封闭：37度，20分钟。7. 一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度，1-2小时。8. 4度PBS洗净，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小时。10. 37度 PBS洗净，3×5 min。11. 凉干封片（封闭液PH8.5）；不管采用何种方法，在使用PBS缓冲液漂洗时...

荧光的产生：一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。免疫荧光技术通过荧光信号的观察来确定抗原或抗体的分布和定位。CD31免疫荧光染色基于荧光成像的技术对于查询细胞和组织的结构和功能方面非常有用。当...

检测复杂的生物学结构需要较高清晰度的荧光信号，并将荧光信号从背景噪声中分离开来。标准的免疫荧光标记很少能够获得较佳信噪比的成像效果。获得良好图片和较佳的可供发表的高质量图像之间的差异就在于：需要精细调整样品信号达到峰值特异性、高清晰度和较佳放大倍数。虽然荧光基团是进行高质量细胞成像的较佳选择，但不可避免地也极易发生光漂白，即荧光信号的光化学降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能导致数据出现偏差，产生假性结果。抗淬灭封片剂可以保护荧光标记蛋白的稳定性，维持数周乃至数月的图像信号完整度。免疫荧光技术可以用于研究细胞内蛋白质的定位和表达水平。HBCAg免疫荧光检查荧光物质，荧光色素：许多物质都可产生荧...

免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展较早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。免疫荧光技术是标记免疫技术中发展较早的一种．它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。Coons等于1941年初次采用荧光素进行标记抗体获得成功。经过几十年的发展，该技术已相当成熟。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术。在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所...

其他荧光物质：1．酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基乙酸等。2．镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用较广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，较适合用于分辨荧光免疫测定。所需要的仪器：荧光显微镜、显微荧光分光光度计...

免疫荧光的制作：样品准备（贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等）：对于贴壁细胞：先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理，然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中，用无菌PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片，操作小心，防止细胞脱片。对于悬浮细胞：有2种方法，①先在悬浮液中进行固定步骤，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。②先在悬浮液中进行固定和染色步骤，离心洗脱，然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。对于石蜡切片：免疫荧光中石蜡切片较少，要先进行脱蜡和抗原修复处理。免疫荧光技术可以用于研究心血管系统的疾病...

细胞免疫荧光：细胞种板与细胞爬片制备：1) 细胞密度在90%-95%左右，用预热胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中，充分吹打，使之成单细胞悬液，计数。2)取细胞培养12孔板，在每个孔放爬片的位置根据爬片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴几滴培养基，然后将爬片置于液滴上，压紧，使爬片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，防止加细胞悬液时爬片漂起，造成双层细胞贴片。根据自己的需要选择合适的细胞密度种入12孔板培养板内。3)24h或者48h后，根据细胞生长速度快慢，观察判断细胞密度，约90%时进行细胞免疫荧光。使用已知荧光抗原标记物质来检查相应抗体的方法被称为荧光抗原技术。Histone H2A....

荧光的产生：一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。免疫荧光技术可以用于研究食品安全和生物安全。col-10(COL-X)免疫细胞免疫荧光步骤对大家来说一定是很陌生的，他是一种抗原抗体反应，好像对...

细胞免疫荧光实验注意事项：非特异性染色：是否灭活内源性过氧化物酶；孵育过程中干片；抗原热修复过度。染色过深：一抗浓度过高；染色试浓度过高或孵育时间过长；染色剂浓度过高或孵育时间过长。通常实验室先固定细胞再进行通透，但若检测抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，这样可以通过通透去除一些水溶性蛋白，进而可降低免疫荧光背景和非特异性信号；建议设阴性对照组，消除由于抗体非特异性结合而产生的背景染色；选择醛类固定液时，保持其新鲜度，较好现配现用，使用不新鲜的醛类固定液自发荧光背景会升高。免疫荧光技术可以用于研究植物病理学和农业生产。col-10(COL-X)免疫组化IHC荧光色素：异硫氰酸荧光素（fluo...

细胞免疫荧光步骤是什么呢？步骤：1. 细胞一定要贴在玻片上（较好可以放入24孔板），为后面照像打基础。细胞密度适中，大约60-75%满片即可，否则容易脱片。2. 取出细胞后用4%多聚甲醛固定15分钟，现用现配。（以下各步骤切毋使玻片干燥）3. PBS冲洗；4. 0.1%Triton作用20分钟；5. PBS冲洗；6. 10%正常血清封闭10分钟；7. 加入一抗，4度孵育过夜（找个小瓶盖将小玻片支起来，抗体就不容易溢出），还要记住“砸片”，就是抗体从较高处落到片子上，以分布均匀。抗体稀释度1：60，较常用！8. PBS冲洗4次，各5分钟；9加入荧光二抗，室温30分钟。抗体稀释度1：400，较常用...

免疫荧光法是将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术。免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原...