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cyclinD1免疫组化

来源: 发布时间:2024年04月11日

注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行.DAPI复染核:爬片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液,避光室温孵育10min。封片:爬片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min。玻片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。镜检拍照:切片于荧光显微镜下观察并采集图像。(DAPI紫外激发波长330-380nm,发射波长420nm,发蓝光;FITC激发波长465-495nm,发射波长515-555nm,发绿光;CY3激发波长510-560,发射波长590nm,发红光)。两种抗体同时孵育:由于FIT容易萃灭,因此在孵育抗体时后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。免疫荧光技术在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域具有普遍应用。cyclinD1免疫组化

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免疫荧光实验的注意事项:对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从10min到数小时,一般30min已足够。染色温度多采用室温(25℃左右),高于37℃可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2℃的低温,延长染色时间。低温染色过夜较37℃30min效果好的多。cyclinD1免疫组化免疫荧光是一种常用的生物学实验技术,用于检测和定位特定抗原或抗体。

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细胞免疫荧光简单实验步骤如下:1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小时。2. -20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟。3. PBS洗净:3min×3。4. 1%Triton:25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗净:2×5 min。6. 羊血清封闭:37度,20分钟。7. 一抗,4度过夜,一般要大于18小时或者37度,1-2小时。8. 4度PBS洗净,3 min×5次。9. 二抗37度小于一小时。10. 37度 PBS洗净,3×5 min。11. 凉干封片(封闭液PH8.5);不管采用何种方法,在使用PBS缓冲液漂洗时,都要漂洗干净并且要测下pH值,可以使用PBS多清洗几次,也可以延长PBS清洗时间,如果结果背景较高可以延长漂洗的次数和时。

直接免疫荧光:单抗体(一抗)用于免疫染色和检测目标蛋白。荧光素结合的一抗直接与目标抗原结合,并使用成像显微镜观察。直接免疫荧光的优点:由于无需为两种抗体选择不同的物种反应性,从而降低了物种交叉反应性问题。与间接免疫荧光相比,时间缩短(操作步骤减少)。直接免疫荧光的缺点:不允许通过二抗进行信号放大;检测灵敏度降低;荧光素结合一抗的选择有限;与使用荧光二抗的检测相比,更昂贵。间接免疫荧光:使用两种抗体(一抗和二抗)进行免疫染色并检测目标蛋白。首先,用特异性一抗标记目标蛋白。然后,荧光素结合的二抗(与一抗具有不同的物种反应性)识别结合的抗原-抗体复合物并与一抗结合。由于一个以上的二抗可以与一抗结合,荧光信号被放大,提供了更高的检测灵敏度。荧光抗体技术具有高灵敏度和高特异性,可以实现精确的免疫检测。

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荧光效率:荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光,总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率,与发射荧光光量子的数值成正比。荧光效率=发射荧光的光量分子数(荧光强度)/吸收光的光量子数(激发光强度)。发射荧光的光量子数亦即荧光强度,除受激发光强度影响外,也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱(荧光光谱),即在某一特定波长处有较大吸收峰和较大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的较大吸收峰波长,且测定光波量接近于较大发射光波峰时,得到的荧光强度也较大。荧光抗体法是利用荧光标记的抗体来追踪或检查相应抗原的方法。cyclinD1免疫组化

免疫荧光技术可以用于研究食品安全和生物安全。cyclinD1免疫组化

检测复杂的生物学结构需要较高清晰度的荧光信号,并将荧光信号从背景噪声中分离开来。标准的免疫荧光标记很少能够获得较佳信噪比的成像效果。获得良好图片和较佳的可供发表的高质量图像之间的差异就在于:需要精细调整样品信号达到峰值特异性、高清晰度和较佳放大倍数。虽然荧光基团是进行高质量细胞成像的较佳选择,但不可避免地也极易发生光漂白,即荧光信号的光化学降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能导致数据出现偏差,产生假性结果。抗淬灭封片剂可以保护荧光标记蛋白的稳定性,维持数周乃至数月的图像信号完整度。cyclinD1免疫组化