细胞培养入门到精通，保姆级指南来了！

来源：发布时间：2025-10-13

在生命科学研究中，细胞培养是一项基础且**的技术 —— 小到分子机制探索，大到药物筛选、细胞***研发，都离不开健康、稳定的细胞体系。但对新手而言，细胞污染、生长缓慢、形态异常等问题常常让人头疼；即使是***研究者，也可能因操作细节疏忽导致实验 “翻车”。***，我们就从细胞培养的**原理出发，梳理从准备工作到日常维护的全流程要点，再聊聊常见问题的解决方案，帮你轻松搞定细胞培养！

from clipboard

一、细胞培养前：做好这些准备，成功一半

细胞对环境极其敏感，温度、湿度、无菌状态等任何微小偏差，都可能影响其生长。因此，实验前的准备工作必须 “精益求精”。

1. **耗材：选对、灭菌是关键

细胞培养的耗材直接接触细胞，其质量和无菌性是基础中的基础，常见耗材及注意事项如下：

from clipboard

培养容器：根据实验需求选择培养皿（直径 6cm/10cm）、培养瓶（T25/T75/T175）或多孔板（6 孔 / 12 孔 / 24 孔 / 96 孔）。优先选择TC 处理（组织培养处理）的耗材 —— 这类耗材表面经过特殊涂层，能促进细胞贴壁生长（悬浮细胞可忽略此要求）。使用前需检查包装是否完好，避免因运输或储存不当导致污染。

培养基与添加剂：不同细胞系对培养基的需求差异极大，比如 HeLa 细胞常用 DMEM，CHO 细胞偏好 F12，原代细胞则可能需要**培养基。关键注意点：

✅ 培养基需添加胎牛血清（FBS）（通常终浓度 10%-20%），提供细胞生长所需的营养因子；

✅ 加入双抗（青霉素 - 链霉素）（终浓度 1%），预防细菌污染（特殊实验如细胞***需无抗培养）；

✅ 部分细胞需额外添加特定因子，如内皮细胞需 VEGF，神经细胞需 BDNF，需严格参照细胞说明书。培养基配制后需 4℃避光储存，且储存时间不超过 2 周，避免营养成分降解。

其他耗材：移液管、离心管、***头需选择无菌无酶规格，避免酶类物质破坏细胞膜；酒精棉球、无菌手套、口罩需提前准备，确保操作过程无菌。

2. 仪器检查：确保设备处于比较好状态

细胞培养依赖的**仪器需提前调试，避免实验中 “掉链子”：

CO₂培养箱：温度需稳定在 37℃（误差 ±0.5℃），CO₂浓度通常为 5%（维持培养基 pH 稳定，依赖 NaHCO₃缓冲体系），相对湿度保持在 95% 以上（防止培养基蒸发）。使用前需用酒精擦拭内壁，定期（每 1-2 周）进行紫外消毒，避免霉菌滋生。

超净工作台：开启前需紫外线消毒 30 分钟，消毒后通风 15 分钟再进行操作（避免紫外线残留损伤细胞）。操作时需保持台面整洁，*放置必要耗材，避免手臂频繁进出破坏无菌环境。

离心机：用于细胞传代或换液时的离心操作，需提前校准转速（通常细胞离心转速为 1000-1500rpm，时间 3-5 分钟，避免转速过高损伤细胞）。

倒置显微镜：用于观察细胞形态和生长状态，需提前调整焦距和光源，确保视野清晰。

二、细胞培养中：掌握**操作，避免 “踩坑”

细胞培养的日常操作主要包括换液和传代，这两个步骤直接决定细胞的生长状态，需严格遵循规范。

1. 换液：及时补充营养，移除代谢废物

当培养基颜色从桃红色（pH 正常）变为黄色（pH 下降，代谢废物积累），或细胞生长至 50%-70% 密度时，需进行换液：

准备工作：将新鲜培养基提前从 4℃取出，复温至室温（约 30 分钟，避免低温刺激细胞）；超净工作台紫外线消毒后通风，戴无菌手套、口罩，用 75% 酒精擦拭双手和耗材表面。

操作步骤：

打开培养箱，取出培养皿 / 瓶，用酒精棉球擦拭外壁后放入超净台；

用移液管轻轻吸出旧培养基（注意避免吸到贴壁细胞，悬浮细胞需先离心收集再换液）；

用无菌 PBS（磷酸盐缓冲液）清洗细胞 1-2 次（移除残留的血清和代谢废物，避免影响新培养基营养）；

加入适量新鲜培养基（培养皿直径 6cm 加 2-3ml，T25 培养瓶加 5ml，确保覆盖细胞即可，过多会浪费且影响气体交换）；

轻轻晃动培养容器，使培养基均匀分布，放回 CO₂培养箱。

2. 传代：避免细胞过度生长，维持活性

当贴壁细胞生长至 80%-90% 融合度（细胞铺满培养皿表面，无明显间隙），或悬浮细胞密度达到 1×10⁶-5×10⁶ cells/ml 时，需进行传代，防止细胞因空间不足或营养匮乏进入衰老期：

贴壁细胞传代（以胰酶消化法为例）：

按换液步骤移除旧培养基，用 PBS 清洗细胞 1 次；

加入适量胰酶（T25 培养瓶加 1ml，覆盖细胞表面即可），放入 37℃培养箱孵育 1-3 分钟（不同细胞对胰酶敏感性不同，需在显微镜下观察，当细胞间隙增大、开始脱落时立即终止消化）；

加入含血清的新鲜培养基（血清中的胰酶抑制剂可终止消化），用移液管轻轻吹打细胞（动作要轻柔，避免产生过多气泡损伤细胞），制成单细胞悬液；

取适量细胞悬液（根据传代比例，通常 1:2-1:5 传代，如 T25 瓶细胞传到 2-5 个新 T25 瓶），加入新鲜培养基，混匀后放回培养箱。

悬浮细胞传代：

直接将细胞悬液转移至离心管，1000rpm 离心 5 分钟；

弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞；

按比例分装到新的培养容器中，放回培养箱。

三、细胞培养后：观察与记录，及时发现问题

细胞培养不是 “一放了之”，每天的观察和记录至关重要，能帮助我们及时发现异常，避免实验损失。

1. 日常观察要点

每天在倒置显微镜下观察细胞，重点关注 3 个方面：

细胞形态：不同细胞有其特征形态，如 HeLa 细胞呈上皮样、梭形，CHO 细胞呈圆形或多边形。若细胞出现皱缩、破碎、贴壁不牢，可能是消化过度、污染或培养基不适导致。

生长密度：记录细胞融合度（贴壁细胞）或密度（悬浮细胞），判断是否需要换液或传代。若细胞生长缓慢，需排查培养基是否过期、血清质量是否下降、培养箱温度 / CO₂浓度是否异常。

是否污染：污染是细胞培养的 “天敌”，常见污染类型及识别方法：

细菌污染：培养基迅速变浑浊（黄色或乳白色），显微镜下可见大量小圆点，快速游动或布朗运动；

***污染：培养基表面出现白色、绿色或黑色菌丝，或出现圆形孢子，污染初期培养基可能不变浑浊，但细胞会逐渐死亡；

支原体污染：支原体直径* 0.2-0.3μm，普通光学显微镜下难以观察，需通过支原体检测试剂盒（如 PCR 法、荧光染色法）鉴定，污染后细胞生长缓慢、形态异常，且会影响实验结果（如干扰细胞信号通路、改变基因表达）。

2. 记录与冻存

实验记录：每次操作（换液、传代、观察）需详细记录，包括日期、细胞名称、操作步骤、细胞状态（形态、密度）、培养基批次、血清批次等，便于后续追溯问题。

细胞冻存：当细胞生长状态良好时，需及时冻存，避免细胞长期传代导致遗传漂变或污染丢失。冻存液通常为 “培养基：血清：DMSO=7:2:1”（DMSO 为冷冻保护剂，需缓慢加入，避免损伤细胞），冻存过程需遵循 “梯度降温” 原则：4℃放置 30 分钟→-20℃放置 1-2 小时→-80℃过夜→转入液氮长期储存。

四、常见问题 troubleshooting：解决你的 “细胞焦虑”

即使操作规范，细胞培养中也可能出现各种问题，以下是高频问题及解决方案：