珠海微量Real-time PCR原理及步骤

Real-time PCR：实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数较敏感、较准确的方法。如果用于RNA检测，这被称为逆转录实时PCR即（Real-timeRT-PCR）是实时PCR法，它是指对DNA或经过反转入（RT-PCR）的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。Real-time PCR的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。实时荧光定量PCR法较大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。该技术不单单实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段。珠海微量Real-time PCR原理及步骤

Real-time PCR原理：Real-time PCR主要指在PCR反应体系中加入荧光物质，然后通过荧光化学物质监测每次PCR反应循环后产物总量的方法，之后通过内参法或外参法对待测样品中的特定DNA序列（目的基因）进行定量分析的方法。实验过程中，这些荧光物质可以在激发光的作用下释放出一定波长的发射光，定量用PCR仪通过对这些发射光进行实时监测，较终可以描绘出整个PCR的反应过程，这就是Real-time PCR的原理。Real-time PCR链式反应：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活。上海特殊样本荧光定量PCR服务Real-time PCR在实验内参的设定主要为了用于靶RNA的定量。

Real-time PCR链式反应的特点：灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在细菌学中很小检出率为3个细菌。简便、快速：PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。武汉微量Real-time PCR供应商聚合酶链反应的试剂应分配到一次性的等分试样中。

Real-time PCR：Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量较准确，重现性较好的定量方法，已得到全世界的公认，普遍用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。实时荧光定量PCR的定量方法，在Real-time PCR中，模板定量有两种策略，相对定量和定量。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数较敏感、较准确的方法。

聚合酶链式反应生物学研究的历史中占据了重要的地位。以此为基础发展出包括Real-time PCR在内的多项应用技术。自诞生后Real-time PCR技术持续发展，从简单的增扩到整个PCR过程，Real-time PCR表现出比PCR更敏感、更明确的定量分析特性和对识别等位基因的能力。不少人以为real-time就是意味着可以在显示器上看到每个循环增扩曲线的增长。事实并非如此，早期的软件不能在运行期间提供可视化的增扩曲线。主要是因为SDS软件采用整个平台较终的数据执行数据分析工作，而不是分析每个单独的反应循环。对某些设备来说，必须向分析软件提供实时的数据，有些设备则不需要。前一种设备允许软件实时跟踪每个加样口的增扩曲线，同时显示在电脑屏幕上。Real-time PCR在实验过程中为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。广州特殊样本定量PCR哪家好

Real-time PCR从用途上分可以分为定性分析和定量分析。珠海微量Real-time PCR原理及步骤

Real-time PCR：所谓Real-time PCR技术，是指在PCR反应体系中加入萤光基团，利用萤光信号累积实时监测整个PCR进程，之后通过标準曲线对未知模板进行定量分析的方法。利用萤光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标準曲线的分析对起始模板进行定量分析。Real-time PCR技术即实时萤光定量PCR避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差，提高实验的重複性。该技术已经被普遍用于监测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因晶片，siRNA干扰的实验结果。珠海微量Real-time PCR原理及步骤

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