温州分子生物学数字PCR设计公司

聚合酶链式反应是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。工具/原料：扩增缓冲液，四种dNTP，引物，模板DNA，Taq DNA聚合酶， Mg离子，蒸馏水。模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合。温州分子生物学数字PCR设计公司

聚合酶链式反应：模板的制备，PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、菌类等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。温州分子生物学数字PCR设计公司为了很大限度地减少污染的可能性，调查人员应该为试剂制备、聚合酶链反应和产品分析预留单独的房间。

聚合酶链反应：热启动聚合酶链式反应:一种在PCR的初始建立阶段减少非特异性扩增的技术。它可以通过将反应组分加热到变性温度(例如95 c)在加入聚合酶。[36]已经开发了特殊的酶系统，通过结合抗体来抑制聚合酶在环境温度下的活性[37][37]或者通过共价键结合的抑制剂的存在，该抑制剂在高温活化步骤后解离。热启动/冷完成聚合酶链反应是通过新的杂合聚合酶实现的，这些酶在环境温度下不活跃，在伸长温度下立即。序列间特异性聚合酶链反应(ISSR):一种用于DNA指纹识别的聚合酶链反应方法，它放大简单重复序列之间的区域，以产生扩增片段长度的独特指纹。电子聚合酶链反应(数字聚合酶链反应、虚拟聚合酶链反应、电子聚合酶链反应、电子聚合酶链反应)是指计算工具使用给定的一组引物 ( 探针)来扩增来自测序的基因组或转录组的DNA 序列，用于计算理论聚合酶链反应结果。电子PCR被提出作为分子生物学的教育工具。

聚合酶链反应：嵌套聚合酶链反应:通过减少DNA非特异性扩增的背景，提高DNA扩增的特异性。两组引物用于两个连续的PCR。在个反应中，一对引物用于产生DNA产物，除了预期的靶之外，该产物可能仍然由非特异性扩增的DN段组成。然后用一组引物将产物用于第二次聚合酶链反应，所述引物的结合位点完全或部分不同于次反应中使用的每个引物，并且位于其中的3’。嵌套式PCR在特异性扩增长DN段方面通常比传统PCR更成功，但它需要更详细的目标序列知识。重叠延伸聚合酶链反应或者通过重叠延伸拼接(SOEing):一种用于将两个或多个含有互补序列的DN段拼接在一起的基因工程技术。它用于连接含有基因、调节序列或突变的DN段；这项技术可以创造特定的长DNA构建体。它还可以将缺失、插入或点突变引入DNA序列。重叠延伸聚合酶链反应可以将缺失、插入或点突变引入DNA序列。

聚合酶链式反应的特点：灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在细菌学中很小检出率为3个细菌。简便、快速：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。聚合酶链式反应：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。南通骨头荧光PCR应用

聚合酶链反应具有定量合成产物的优点。温州分子生物学数字PCR设计公司

聚合酶链式反应的常见问题：出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。温州分子生物学数字PCR设计公司