厦门血液数字PCR原理

Real-time PCR原理：Real-time PCR主要指在PCR反应体系中加入荧光物质，然后通过荧光化学物质监测每次PCR反应循环后产物总量的方法，之后通过内参法或外参法对待测样品中的特定DNA序列（目的基因）进行定量分析的方法。实验过程中，这些荧光物质可以在激发光的作用下释放出一定波长的发射光，定量用PCR仪通过对这些发射光进行实时监测，较终可以描绘出整个PCR的反应过程，这就是Real-time PCR的原理。Real-time PCR链式反应：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团。厦门血液数字PCR原理

Real-time PCR-传统定量PCR：1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。连云港特殊样本荧光PCR网站由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

聚合酶链反应注意事项：在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；内参的设定主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差；PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定；防止DNA的污染：采用DNA酶处理RNA；在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。聚合酶链反应可以选择这些突变来理解蛋白质是如何完成其功能的，并改变或改善蛋白质功能。

Real-time PCR与普通PCR的实验目的不同，所以对引物的设计要求也不同。普通PCR的实验目的只是为了获得目的基因产物，允许有非特异扩增，只要目标条带清晰明亮，就可以通过切胶回收的方法回收目标条带，之后进行后续的克隆、测序。但Real-time PCR的目的是为了让目的基因按照理论值或是按照接近理论值进行扩增，只有这样的扩增后续由Ct值推算出的起始量模板量才准确，基于此，Real-time PCR对非特异性扩增和引物二聚体的存在有较严格的要求。Real-time PCR在实验过程中要防止RNA的降解。

Real-time PCR：实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数较敏感、较准确的方法。如果用于RNA检测，这被称为逆转录实时PCR即（Real-timeRT-PCR）是实时PCR法，它是指对DNA或经过反转入（RT-PCR）的RNA通过聚合酶链式反应并实时监测DNA的放大过程，在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。Real-time PCR的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。实时荧光定量PCR法较大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。该技术不单单实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。Real-time PCR与普通PCR的实验目的不同，所以对引物的设计要求也不同。珠海特殊样本RT-PCR检测技术原理及步骤

聚合酶链反应为这些技术提供了大量的纯DNA，有时是单链的。厦门血液数字PCR原理

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