南通分子生物学数字PCR研究方案

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DN段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的很大特点是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到2013年，PCR已发展到第三代技术。重叠延伸聚合酶链反应用于连接含有基因、调节序列或突变的DN段。南通分子生物学数字PCR研究方案

引物的设计注意事项：1，引物设计要跨内含子，不能在一个外显子上（我们的实验是以cDNA为模板来扩增的，如果有DNA污染的话，因为DNA上含有分子量很大的内含子，不可能完成扩增。这对我们消除整个实验的误差起很大的作用）。2，引物设计的时候要尽可能设计在同一退火温度，方便于以后同时扩增很多不同的基因片段。但是如果相差比较大，就得分开做，浪费模板，浪费管家基因，所以每个实验室设计引物的时候要尽可能一致，这样就不用每次查退火温度，且对整个实验有利。徐州微量数字PCR研究方案Real-time PCR技术即实时萤光定量PCR避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差。

Real-time PCR双荧光标记探针设计原则：具体的其他要求可以具体联系设计公司，拿到合成好的引物，需要先确认引物的性能。可以用这对引物先扩增梯度稀释后的标准品（标准品介绍见后续内容）。由不同梯度标准品的加量和其对应的Ct值，描绘出一条标准曲线。这里要注意根据标准曲线得到的参数是非常重要的。引物性能确认：1.决定系数R2大于0.98，越接近于1，结果越可靠。2.扩增效率一般要求在0.8-1.2，越接近于1，越好。3.检测的灵敏度，必须确认，通常要求35个循环以内，一般可以得到比较好的定量结果，30个循环以内，没有非特异性扩增产生。4.NTC是必须要确认的，通常要求30个循环内没有引物二聚体产生。

Real-time PCR操作流程：1、收集样品。2相关试剂总RNA提取试剂TREzolReagent(RNA提取试剂),M-MLV（cDNA逆转录酶）,RNA纯化试剂,RealqPCRMasterMix（萤光定量PCR预混试剂）。3实验仪器萤光定量PCR仪;PCR仪；低温离心机。4总RNA提取。5cDNA合成在0.5ml的离心管中加入1µl模板总RNA（1µg/µl）；Real-time PCR操作流程：2µl随机引物（T18,10pmol/ul）；2µl10mMdNTPmix；加水至15µl体系。混匀后70℃变性RNA5分钟，冰上速冷1分钟，离心将溶液收集至管底加入6µl5×PCRbuffer；1µlRNaseout；1µlM-MLVRT；加水至30µl体系。PCR仪中反应条件设定37℃延伸60min，70℃保温15min终止反应。合成好的cDNA置于-20℃保存备用。聚合酶链式反应的特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

Real-time PCR：对扩增技术的修饰可以从完全未知的基因组中提取片段，或者可以产生感兴趣区域的单链。聚合酶链反应有许多应用于传统的DNA克隆。它可以从更大的基因组中提取片段以插入载体，这可能只有少量可用。使用一组“载体引物”，它还可以分析或提取已经插入载体的片段。聚合酶链反应方案的一些改变可以产生突变(通用的或定点的)插入片段。聚合酶链反应可以选择这些突变来理解蛋白质是如何完成其功能的，并改变或改善蛋白质功能。聚合酶链反应可以选择这些突变来理解蛋白质是如何完成其功能的，并改变或改善蛋白质功能。武汉血液荧光定量PCR原理

序列间特异性聚合酶链反应是一种用于DNA指纹识别的聚合酶链反应方法。南通分子生物学数字PCR研究方案

Real-time PCR式反应准备：10×扩增缓冲液、4种dNTP混合物（终浓度）、引物（终浓度）、模板DNA、TaqDNA聚合酶、Mg2+（终浓度）、补加双蒸水等。其中dNTP、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整，以上表格只提供大致参考值。PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物(PCR引物为DN段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。引物有多种设计方法，由PCR在实验中的目的决定，但基本原则相同。南通分子生物学数字PCR研究方案

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