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聚合酶链反应的常见问题分析与解决方法：PCR产物量过少：退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。DNA模板量太少。增加DNA模板量。PCR循环数不足。增加反应循环数。引物量不足。增加体系中引物含量。延伸时间太短。以1 kb/min的原则设置延伸时间。变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净。扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散：酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。像所有酶一样，DNA聚合酶也容易出错，这反过来会导致产生的PCR片段发生突变。宁波分子生物学Real-time PCR网站

聚合酶链式反应：Taq(水生栖热菌)聚合酶耐热DNA聚合酶的很好活性温度约为75-80°C(167-176°F),尽管该酶通常使用72°C(162°F)的温度。在该步骤中，DNA聚合酶通过从反应混合物中添加在5’-至-3’方向上与模板互补的游离DNA链来合成与DNA模板链互补的新DNA链，在新生(伸长)DNA链的末端，将dNTPs的5'-磷酸基与3'-羟基缩合。延伸所需的精确时间取决于所使用的DNA聚合酶和要扩增的DNA目标区域的长度。根据经验，在很好温度下，大多数DNA聚合酶每分钟聚合一千个碱基。在很好条件下(即，如果没有限制底物或试剂的限制)，在每个延伸/延伸步骤中，DNA靶序列的数量加倍。随着每一个连续的循环，原始模板链加上所有新产生的链成为下一轮延伸的模板链，导致特定DNA目标区域的指数(几何)扩增。杭州特殊样本Real-time PCR原理聚合酶链式反应中的DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构。

聚合酶链式反应：反应的控制：PCR反应的缓冲液 提供合适的酸碱度与某些离子；镁离子浓度 总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L；底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L；TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）；引物浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L；反应温度和循环次数；变性温度和时间 95℃，30s；退火温度和时间 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃；延伸温度和时间 72℃，1min/kb(10kb内）；Tm值=4(G+C) +2(A+T)；循环次数 ：一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的 扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。

聚合酶链反应的常见问题分析与解决方法：扩增产物出现多条带(杂带)：引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。 样品处理不当。Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。序列间特异性聚合酶链反应放大简单重复序列之间的区域，以产生扩增片段长度的独特指纹。

聚合酶链式反应是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DN段，并能轻易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DN段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而较广地用于分子生物学的各个领域。　异常结果： 各种疾病所致的异常，例如梅毒。一期梅毒。即硬下疳 ，潜伏期2-4周，外生殖器部位发生暗红色硬肿块 、浅溃疡 ，有软骨样硬度，周围淋巴结肿大。二期梅毒。在一期梅毒 1-2 个月之后，全身皮肤、粘膜发生对称泛发皮疹、斑疹、、疹等。粘膜可发生粘膜斑、扁平湿疣，传染性强。三期梅毒。发生在染上后2-3年乃至10年，皮肤为树胶样肿，还可涉及骨、关节、心、血管，表现为主动脉炎、主动脉瓣闭锁不全和主动脉瘤等，侵及神经为脊髓痨 ，全身麻痹 ( 麻痹性痴呆 )等等。　需要检查的人群：疑似某种特定的疾病病人，进行分子特异性检查。重叠延伸聚合酶链反应用于连接含有基因、调节序列或突变的DN段。杭州特殊样本Real-time PCR原理

如果基因的基因组DNA序列是已知的，逆转录-聚合酶链反应可以用来绘制基因中外显子和内含子的位置。宁波分子生物学Real-time PCR网站

聚合酶链式反应的常见问题：PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些很好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。假阴性：不出现扩增条带。PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及溴乙锭的使用， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。宁波分子生物学Real-time PCR网站

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