台州实时PCR检测技术

聚合酶链反应：在检测病原体方面,病原体培养是临床诊断的金标准 .但是对于一些苛养菌 生长缓慢的细菌或难以培养的病原体等培养的阳性检出率不高.检测时间过长 无法满足临床早期快速诊断以指导医治的需要[3]。当前 PCR 技术是在传统 PCR 技术应用的基础上进行的改进，包括实时定量 PCR 技术 、 实时荧光定量PCR、 PCR-酶联免疫吸附试验 、 巢式PCR等。 在PCR技术的辅助作用下，实验室检测也逐渐从生化免疫诊断过渡到基因诊断，生化免疫检测主要从表型表现评估病症，而基因诊断则深入本质探究其病因，以PCR 技术为主的核酸技术在临床实验室检测与疾病诊断中表现出了明显的应用价值，在未来的临床医学检验中必将会得到更加较广的应用。聚合酶链反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液。台州实时PCR检测技术

聚合酶链式反应准备：PCR引物设计：PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。引物设计的基本原则：引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC很好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。台州实时PCR检测技术聚合酶链反应可用于产生突变基因，突变由科学家随意选择。

聚合酶链反应的常见问题分析与解决方法：PCR产物量过少：退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。DNA模板量太少。增加DNA模板量。PCR循环数不足。增加反应循环数。引物量不足。增加体系中引物含量。延伸时间太短。以1 kb/min的原则设置延伸时间。变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净。扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散：酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。

逆转录-聚合酶链反应的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。完整RNA 的提取和纯化，是进行RNA 方面的研究工作，如Nothern杂交、mRNA 分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点，即样品细胞或组织的有效破碎；有效地使白复合体变性；对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中很关键的是抑制RNA酶活性。RNA 的提取目前阶段主要可采用两种途径，提取总核酸，再用氯化锂将RNA 沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA 留在水相。种提取方法将导致小分子量RNA 的丢失，目前该方法的使用频率已很低。逆转录酶将核糖核酸逆转录成cDNA ，然后通过聚合酶链反应进行扩增。

聚合酶链反应也可以用作以下敏感试验的一部分组织分型，对移植至关重要。截至2008年，甚至有人提议用聚合酶链反应检测取代传统的血型抗体检测。许多形式的病症涉及致病基因的改变。通过使用基于聚合酶链反应的测试来研究这些突变，医治方案有时可以根据患者的不同而不同。聚合酶链反应可以早期诊断恶性疾病，如白血病和淋巴瘤，这是目前病症研究中发展很快的，并且已经被常规使用。PCR检测可以直接在基因组DNA样品上进行，以检测易位特异性恶性细胞，其灵敏度至少是其他方法的10，000倍。聚合酶链反应在医学领域非常有用，因为它允许分离和扩增病症抑制剂。例如，定量PCR可以用于量化和分析单细胞，以及识别DNA、mRNA和蛋白质的确认和组合。热启动聚合酶链式反应：一种在PCR的初始建立阶段减少非特异性扩增的技术。台州实时PCR检测技术

聚合酶链反应很容易理解和使用，并迅速产生结果。台州实时PCR检测技术

基于聚合酶链反应的遗传(或脱氧核糖核酸)指纹图谱协议的发展已在法医学中得到较广应用：遗传指纹以其辨别力的形式，可以从世界上所有人群中独特地区分任何一个人。微小的DNA样本可以从犯罪现场，和比较的从嫌疑人那里，或者从DNA资料库早期的证据或罪犯。这些测试的简单版本通常用于在刑事调查中快速排除嫌疑人。几十年前的犯罪证据可以被检验，确认或免责很初被定罪的人。脱氧核糖核酸指纹中较小的区别有助于亲子鉴定，在亲子鉴定中，一个人和他的近亲相匹配。可以测试未知人类遗骸的DNA，并与可能的父母、兄弟姐妹或儿童进行比较。类似的测试可以用来确认被收养(或)孩子的亲生父母。新生儿的实际生父也可以被确认(或排除)。台州实时PCR检测技术

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