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聚合酶链式反应的特点：特异性强，PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。逆转录酶将核糖核酸逆转录成cDNA ，然后通过聚合酶链反应进行扩增。杭州细胞Real-time PCR供应商

聚合酶链反应的常见问题分析与解决方法：MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。模板量过多。质粒DNA的用量应<50 ng，而基因组DNA则应<200 ng。引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。退火温度过低。电泳体系有问题：凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；凝胶没有凝固好；琼脂糖质量差。若为PCR试剂盒则可能：由于运输储存不当引起试剂盒失效；试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。杭州细胞Real-time PCR供应商聚合酶链反应可以用于分析病症、微生物或其他疾病状态中基因表达水平的变化。

聚合酶链式反应准备：PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择。模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制。缓冲液的成分很为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA解除缠绕结构。

聚合酶链式反应的循环参数：预变性，模板DNA完全变性与PCR酶的完全对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶时间为两分钟。变性步骤，循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。引物退火，退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。引物延伸，引物延伸一般在72℃进行（Taq酶很适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。循环数，大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。延伸，在一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。电子PCR被提出作为分子生物学的教育工具。

聚合酶链式反应的试验污染：实验室中克隆质粒的污染：在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力。其污染可能性也很大。污染的监测：一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。重复性试验。选择不同区域的引物进行PCR扩增。聚合酶链式反应可看作是生物体外的特殊DNA复制。南通细胞荧光PCR服务

PCR反应的特异性决定因素为：引物与模板DNA特异正确的结合。杭州细胞Real-time PCR供应商

逆转录-聚合酶链反应的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。完整RNA 的提取和纯化，是进行RNA 方面的研究工作，如Nothern杂交、mRNA 分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点，即样品细胞或组织的有效破碎；有效地使白复合体变性；对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中很关键的是抑制RNA酶活性。RNA 的提取目前阶段主要可采用两种途径，提取总核酸，再用氯化锂将RNA 沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA 留在水相。种提取方法将导致小分子量RNA 的丢失，目前该方法的使用频率已很低。杭州细胞Real-time PCR供应商