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来源: 发布时间:2025年07月08日

双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是:在高光子密度的情况下,荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子,在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后,发射出一个波长较短的光子;其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双(多)光子成像优势在于,具有更深的组织穿透深度,利用红外光,能够在层面检测极限达1mm的组织区域;因信号背景比高,而具有更高的对比度;因激发体积小,具有定点激发的特性,具有更少的光毒性;激发波长由紫外、可见光调整为红外激发,能够更加地安全。双光子显微镜工作原理是利用两个光子的能量相加达到荧光激发能量阈值,来激发样品中荧光分子发出荧光信号。美国investigator双光子显微镜价位

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要想让激发激光进入更深的层面,大致可从两个方面入手,装置优化与标本改造。关于装置优化,我们可以把激光束变得更细,使能量更加集中,就能让激光穿透更深。关于标本,其中影响光传播的主要是物质吸收和散射,解决这个问题,我们需要对样本进行透明化处理。一种方法是运用某种物质将标本浸泡,使其中的物质(主要是脂质)被破坏或溶解。另一种方法是运用电泳将脂质电解,让标本“透明度”提高。高光子密度带来的高能量容易损伤细胞,所以双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脉冲达到最大值所持续的周期只有十万亿分之一秒,而其频率可以达到80至100兆赫,这样即能达到双光子激发的高光子密度要求,又能不损伤细胞,使扫描能更好地进行。进口荧光双光子显微镜光子探测双光子显微镜成像技术及不同转基因小鼠开展对多种脏器的成像研究。

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双光子显微镜是一种先进的成像技术,可以在保持细胞活性的情况下,对深层组织进行高分辨率成像。它主要用于生物学、医学和材料科学等领域的研究。双光子显微镜的重心技术是基于双光子激发的荧光成像。当激光通过样品时,它会吸收特定波长的光子,然后发出荧光。双光子显微镜使用两个连续的光子同时激发样品,这样可以在保持样品完整性的同时,获得高质量的图像。双光子显微镜具有以下优点:1.高分辨率:由于双光子激发的特性,它可以获得比传统显微镜更高的分辨率。2.深层成像:由于激光的穿透深度限制,传统的光学显微镜无法对深层组织进行成像。而双光子显微镜可以解决这个问题,因为它可以激发样品的深层荧光。3.活细胞成像:双光子显微镜可以在保持细胞活性的情况下进行成像,这对于研究细胞生理学和生物化学过程非常有用。4.多模式成像:双光子显微镜可以结合多种技术,如光谱成像、钙离子成像和神经活动成像等,以提供更丰富的生物样品信息。总之,双光子显微镜是一种强大的研究工具,可以对深层组织和活细胞进行无损成像。这使得它在生物学、医学和材料科学等领域的研究中具有广泛的应用。

双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主提出,30年后因为有了激光才得到实验验证,但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用,首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程,这要求极高的电场强度,而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小,脉宽越窄,双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜,聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关,所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析,能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势:只有焦平面处才能形成双光子吸收,而焦平面之外由于光强低无法被激发,所以双光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飞秒激光器(100fs脉宽、630nm可见光波长)。虽然染料激光器对于实验室演示尚可,但是使用很不方便所以远未实现商用。很快双光子显微镜的标配光源就变成了飞秒钛宝石激光器。除了固态光源优势,钛宝石激光器还具有较宽的近红外波长调谐范围,而近红外相比可见光穿透更深,对生物样品损伤更小。双光子显微镜大量运营在实验室当中;

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双光子的来源:飞秒激光的双光子吸收理论早在1931年就由诺贝尔奖获得者MariaGoeppertMayer提出,并在30年后因为激光而得到实验验证,但WinfriedDenk用了近30年才发明了双光子显微镜。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用,首先要理解非线性过程。双光子吸收相当于和频产生的非线性过程,需要极高的电场强度,电场取决于聚焦光斑的大小和激光脉冲宽度。聚焦光斑越小,脉冲宽度越窄,双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜,聚焦在样品上的光斑大小只与物镜NA和激光波长有关,所以关键变量只有激光脉冲宽度。基于以上分析,能够输出高重复率(100MHz)的超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光已经成为双光子显微镜的标准激发光源。这再次显示了双光子显微镜的优势:双光子吸收只能在焦平面形成,而在焦平面之外,由于光强较低,无法激发,所以双光子成像更清晰。双光子显微镜已延伸到各个领域研究中,它能对样品进行三维观察。国外investigator双光子显微镜光刺激

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双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出,30年后因为有了激光才得到实验验证,但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用,首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程,这要求极高的电场强度,而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小,脉宽越窄,双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜,聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关,所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析,能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势:只有焦平面处才能形成双光子吸收,而焦平面之外由于光强低无法被激发,所以双光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飞秒激光器(100fs脉宽、630nm可见光波长)。虽然染料激光器对于实验室演示尚可,但是使用很不方便所以远未实现商用。很快双光子显微镜的标配光源就变成了飞秒钛宝石激光器。除了固态光源优势,钛宝石激光器还具有较宽的近红外波长调谐范围,而近红外相比可见光穿透更深,对生物样品损伤更小。美国investigator双光子显微镜价位