双光子之源:飞秒激光:双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主MariaGoeppertMayer提出,30年后因为有了激光才得到实验验证,但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用,首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程,这要求极高的电场强度,而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小,脉宽越窄,双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜,聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关,所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析,能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势:只有焦平面处才能形成双光子吸收,而焦平面之外由于光强低无法被激发,所以双光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飞秒激光器(100fs脉宽、630nm可见光波长)。虽然染料激光器对于实验室演示尚可,但是使用很不方便所以远未实现商用。很快双光子显微镜的标配光源就变成了飞秒钛宝石激光器。除了固态光源优势,钛宝石激光器还具有较宽的近红外波长调谐范围,而近红外相比可见光穿透更深,对生物样品损伤更小。双光子显微镜型号有哪些?进口ultimainvestigator双光子显微镜多少钱
双光子显微镜是激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术相结合的新技术。双光子激发的基本原理是:在光子密度较高的情况下,荧光分子可以同时吸收两个波长较长的光子,经过短暂的所谓激发态寿命后,发射一个波长较短的光子;效果和用波长为长波长一半的光子激发荧光分子是一样的。双(多)光子成像的优点是具有更深的组织穿透深度,红外光可以在平面上探测到极限为1mm的组织区域;因为信号背景比高,所以具有更高的对比度;由于激发体积小,具有定点激发、光毒性小的特点;激发波长由紫外、可见光调整为红外激发,更加安全。进口bruker双光子显微镜厂家双光子显微镜在组织透明化成像中应用;
WinfriedDenk使用的第1个光源是染料飞秒激光(脉冲宽度100fs,可见光波长630nm)。染料激光虽然实验室演示可以接受,但是使用起来不方便,所以离商业化还很远。很快双光子显微镜的标准光源变成了飞秒钛宝石激光器。钛宝石激光器除了具有固态光源的优点外,还具有近红外波长调谐范围宽,而近红外比可见光穿透更深,对生物样品的损伤更小。下图是Thorlabs的双光子和三光子显微镜配置,钛宝石飞秒可调谐激光器位于平台左侧。从双光子到三光子科学家们正在从双光子显微镜转向三光子显微镜。1996年,ChrisXu在康奈尔大学(Denk的导师实验室)读博时发明了三光子显微镜。如果双光子吸收是可行的,那么三光子似乎是自然的发展方向。三光子成像使用更长的波长,大约1.3和1.7微米,成像深度比双光子更深。目前录音大约2.2毫米,人的大脑皮层厚度大约4毫米。与双光子显微镜相比,三光子需要使用更强、更短、重复率更低的激光脉冲,这是传统的钛宝石激光器很难满足的,但对于掺镱光纤飞秒光参量放大器,比如我们的Y-Fi光参量放大器(OPA)就非常容易。
从双光子的原理和特点我们就可以明显的得出双光子的优点:☆光损伤小:由于双光子显微镜使用的是可见光或近红外光作为激发光源,这一波段的光对细胞和组织的光损伤小,适用于长时间的研究;☆穿透能力强:相对于紫外光,可见光和近红外光都具有更强的穿透能力,因而受生物组织散射的影响更小,解决对生物组织中深层物质的层析成像研究问题;☆高分辨率:由于双光子吸收截面很小,只有在焦平面很小的区域内可以激发出荧光,双光子吸收局限于焦点处的体积约为波长3次方的范围内;☆漂白区域小:由于激发只存在于交点处,所以焦点以外的区域都不会发生光漂白现象;☆荧光收集率高:与共聚焦成像相比,双光子成像不需要光学滤波器(共焦),这样就提高了对荧光的收集率,而收集率的提高直接导致图像对比度的提高;☆图像对比度高:由于荧光波长小于入射波长,因而瑞利散射产生的背景噪声只有单光子激发时的1/16,降低了散射的干扰;☆光子跃迁具有很强的选择激发性,所以可以对生物组织中一些特殊物质进行成像的研究;双光子显微镜知多少。
TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纤激光器是一种易于操作和免维护的激光系统其输出波长为920nm,非常适合常规荧光基团(如GFP、eGFP、曙红、GCaMP、CFP、钙黄绿素或金星)的双光子激发。它可以为荧光基团提供相对较高的峰值功率,常用于神经科学和其他与激光相关的光子学。此外,其独特的设计(简单和经济的光源)具有创新双光子荧光显微镜发展的潜力。在双光子显微镜中,峰值功率就是亮度!如果你想获得更好的图像亮度,那么你需要短脉冲,高功率,更重要的是,干净的时间脉冲形状。FemtoFiberultra920具有足够高的输出功率、短脉冲、独特的Clean-Pulse技术和相对较高的峰值功率,这使得在双光子显微镜中实现****亮度而无需对样品进行不必要的加热成为可能。FemtoFiberultra920全包式、完全集成的色散补偿(可确保样品处的短脉冲)、内置电源控制、直观的操作及其坚固紧凑的设计使系统具有非常友好的用户体验,是非线性显微镜应用的良好解决方案。例如,荧光蛋白的双光子激发和基于SHG的对比机制这种双光子显微镜的视场是普通显微镜的10倍。国内investigator双光子显微镜的原理
双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。进口ultimainvestigator双光子显微镜多少钱
从双光子到三光子:科学家正在从双光子转向三光子显微镜。1996年,ChrisXu在康奈尔大学(Denk同导师实验室)读博期间发明了三光子显微镜,如果双光子吸收可行,那么三光子看起来也是自然的发展方向。三光子成像使用更长的波长,大约在1.3和1.7微米,其成像深度也比双光子更深,目前记录约为2.2毫米,人类大脑皮层厚约4毫米。相比双光子显微镜,三光子还要求以较低重频使用更强和更短的激光脉冲,而传统的钛宝石激光器难以达到这些要求,但是对于掺镱光纤飞秒光参量放大器则非常容易,比如我们的Y-Fi光参量放大器(OPA)。进口ultimainvestigator双光子显微镜多少钱