美国荧光激光双光子显微镜作用

像差问题一直困扰着光学领域的工作者。像差会使光波前发生形变，不仅降低成像的信噪比和分辨率，使得很多时候我们只能“雾里看花”，更甚者，产生赝像，或无法获得有意义的图像。像差问题对双光子成像的影响尤为严重，因为在那里，荧光信号对入射光强度的依赖是平方关系，一旦入射光波前形变，不仅聚焦强度大幅下降，成像分辨率也急剧恶化。因此，如何解决像差问题，实现，例如小鼠大脑皮层，深层区域的高质量成像成为光学成像发展中相当有挑战性的问题之一。双光子显微镜有哪些应用呢？美国荧光激光双光子显微镜作用

相比普通的显微镜电子显微镜可以观察尺度更小的东西，冷冻电镜更是可以观察有活性的生物大分子，而双光子显微镜有什么优势呢？它能做到什么普通光学显微镜做不到的事情吗？原来，双光子显微镜可以精确穿透较厚标本进行定点、***观察！由于电磁波的波长越短，粒子性越强，受散射影响也就越大。双光子显微镜将激发光源改为长波长激光，在增加了激光的穿透性的同时还减少了对细胞的毒性。除此之外，因为只有物镜焦点处能发生双光子激发效应，所以扫描的精确度极高，也能提高激发光效率，减少被扫描点之外的荧光物质消耗。国外荧光激光双光子显微镜价位双光子显微镜在组织透明化成像中应用；

使用基因编码的荧光探针可以在突触和细胞分辨率下监测体内神经元信号，这是揭示动物神经活动复杂机制的关键。使用双光子显微镜（2PM）可以以亚细胞分辨率对钙离子传感器和谷氨酸传感器成像，从而测量不透明大脑深处的活动；成像膜电压变化能直接反映神经元活动，但神经元活动的速度对于常规的2PM来说太快。目前电压成像主要通过宽场显微镜实现，但它的空间分辨率较差并且只是于浅层深度。因此要在不透明的大脑中以高空间分辨率对膜电压变化进行成像，需要较提高2PM的成像速率。FACED模块输出处的子脉冲序列可以看作从虚拟光源阵列发出的光，这些子脉冲在中继到显微镜物镜后形成了一个空间上分离且时间延迟的焦点阵列。然后将该模块并入具有高速数据采集系统的标准双光子荧光显微镜中，如图2所示。光源是具有1MHz重复频率的920nm的激光器，通过FACED模块可产生80个脉冲焦点，其脉冲时间间隔为2ns。这些焦点是虚拟源的图像，虚拟源越远，物镜处的光束尺寸越大，焦点越小。光束沿y轴比x轴能更好地充满物镜，从而导致x轴的横向分辨率为0.82µm，y轴的横向分辨率为0.35µm。

双光子吸收理论早在1931年就由诺奖得主提出，30年后因为有了激光才得到实验验证，但是到WinfriedDenk发明双光子显微镜又用了将近30年。要理解双光子的技术挑战和飞秒激光发挥的重要作用，首先要了解其中的非线性过程。双光子吸收相当于和频产生非线性过程，这要求极高的电场强度，而电场取决于聚焦光斑大小和激光脉宽。聚焦光斑越小，脉宽越窄，双光子吸收效率越高。对于衍射极限显微镜，聚焦在样品上的光斑大小只和物镜NA和激光波长有关，所以关键变量只剩下激光脉宽。基于以上分析，能够以高重频(100MHz)输出超短脉冲(100fs量级)的飞秒激光器成了双光子显微镜的标准激发光源。这也再次说明双光子显微镜的优势：只有焦平面处才能形成双光子吸收，而焦平面之外由于光强低无法被激发，所以双光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飞秒激光器(100fs脉宽、630nm可见光波长)。虽然染料激光器对于实验室演示尚可，但是使用很不方便所以远未实现商用。很快双光子显微镜的标配光源就变成了飞秒钛宝石激光器。除了固态光源优势，钛宝石激光器还具有较宽的近红外波长调谐范围，而近红外相比可见光穿透更深，对生物样品损伤更小。双光子显微镜厂家就找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司；

对生物样品的三维观测是了解细胞功能的重要方法之一。目前已有的三维荧光成像技术包括光片显微成像技术、晶格光照明技术以及激光扫描显微成像技术（如共聚焦显微镜及双光子显微镜）等。其中激光扫描显微镜利用旋转盘可以进行多焦点的激光扫描，提高时间分辨率，而且有利于减少活细胞成像中的光损伤。本篇文献主要实现了可见光双光子激发及多焦点激光扫描的结合，终提高了3D延时扫描中的空间分辨率及成像对比度，同时这也是可见光双光子激发（v2PE）在超高分辨率显微镜中的应用。双光子显微镜使用高能量锁模脉冲器。进口布鲁克双光子显微镜图像对比度

双光子显微镜将得到更大的发展与更广的应用。美国荧光激光双光子显微镜作用

美国霍华德·休斯医学研究所在Janelia Farm ResearchCampus的吉娜博士小组与来自中科院上海光机所强场激光物理国家重点实验室的王琛博士较近成功将一种新的自适应光学的方法和双光子显微镜结合，研制出一种新的自适应光学双光子荧光显微镜。通过校正小鼠大脑的像差，在视觉皮层的不同深度处均获得了提高数倍的成像分辨率和信号强度，明显改进了成像质量，使得原来在鼠脑中不可见或者模糊的细节变得清晰可见，她们成功将该方法应用于老鼠视觉皮层第五层（约500µm）的形貌结构成像和钙离子功能成像。这一新的自适应光学方法，使得在小鼠深层区域成像中获得近衍射极限的成像分辨率成为现实。这一成果发表在较新一期的《Nature Methods》。美国荧光激光双光子显微镜作用

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