天津N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶疾病机理研究

经过多年的经验积累及市场积淀，倍笃生物已组合多条不同产品线，分别满足体外诊断、organoid及干细胞、细胞基因药物等领域的需求。其中，细胞基因药物领域产品线包含SAN HQ高盐核酸酶及M-SAN HQ中盐核酸酶、泊洛沙姆P 188 Bio、GMP级MSC/PSC培养基、GMP级胶原酶、AAV滴度检测产品、工艺杂质及外源污染物残留检测产品、聚糖分析用酶、ADC偶联技术、QED抗体对、AAV中和抗体、蛋白酶等；相关品牌有挪威ArcticZymes Technologies、德国BASF、德国Sartorius、德国Nordmark、瑞典Genovis、美国QED、中国君研生物等。用SialEXO对依那西普糖蛋白去唾液酸化，并用ProteinSimple成像等电聚焦分析。天津N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶疾病机理研究

与PNGase F类似，Genvois的OmniGLYZOR 水解 N-和粘蛋白型 O-聚糖：糖基化往往是异质的，这使得对高度糖基化的生物zhiliao药物的分析具有挑战性。完整质量数的确认以及其他产品质量属性的表征受到不同糖型复杂性的阻碍，这就是为什么有效的聚糖去除工具简化了此类分析的原因。 虽然 N-聚糖包含一个共同的结构，并且可以通过 PNGase F 整体去除，但粘蛋白型 O-聚糖在结构上更加多样化，具有多个不同的he心。OmniGLYZOR含有固定化酶的混合物，能够依次分解O-聚糖，以完全去除最常见的O-聚糖结构（二唾液酸和单唾液酸基he心1和Tn抗原）。河北N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶糖生物学研究用于糖蛋白的去氟糖基化，而不会用酶污染z终制剂。

SialEXO 2-3 在天然条件下水解糖蛋白，在 pH 值范围为 7.0 至 9.0 时显示出活性。该酶来源于Akkermansia muciniphila，并在大肠杆菌中表达。该酶具有 His 标签，分子量为 66 kDa。1. 用于方法开发的灵活格式；2. 可以结合酶以提高用于离心柱中糖蛋白去唾液酸化的固定化酶。Genovis的SialEXO固定化离心柱含有与琼脂糖珠共价偶联的SialEXO酶，用于糖蛋白的去唾液酸化，而不会被酶污染z终制剂。它水解天然糖蛋白上的唾液酸（α2-3、α2-6 和 α2-8）并释放出聚糖。效率；3. 适用于自动化工作流程；4. 即用型 - 只需加水即可。

Genovis的ImpaRATOR™ 和 OpeRATOR® - 两种协同的作用：O-糖蛋白酶。使用ImpaRATOR或OpeRATOR消化后分析依那西普重糖基化区域O-聚糖位点的覆盖率（图3）。使用OpeRATOR鉴定对应于所有13个O-聚糖位点的肽，而使用ImpaRATOR只能明确鉴定10个位点。ImpaRATOR 可能比 OpeRATOR （1） 具有更具选择性的氨基酸序列偏好，此处由 S186 和 T245 位点缺乏消化来表明。此外，ImpaRATOR 在两个相邻的 O-糖基化氨基酸之间显示出有限的裂解，如 S213 位点酶解肽的缺乏以及 T200 和 T217 位点酶解肽的低强度所证明的那样。在OpeRATOR酶解样品（T184-S199和T200-H204;图2b和d），而在ImpaRATOR消化的样品中，具有漏裂的相应肽（S184-H204）的强度更高。 虽然OpeRATOR显示出更高的O-聚糖位点覆盖率，但使用ImpaRATOR进行消化可以表征O-聚糖结构，包括唾液酸化物种。例如，条形图插入显示了两种糖肽 T184-V198 和 T205-P207 的 O-聚糖种类。这应该与使用OpeRATOR的消化进行比较，在OpeRATOR中，必须去除唾液酸才能产生酶活性，这意味着有关唾液酸化的信息丢失。总而言之，ImpaRATOR 和 OpeRATOR 酶共同提供了有关聚糖组成和 O-聚糖位点的完整信息。使用游离聚糖方法分析zhiliao性抗体曲妥珠单抗、Fc-融合蛋白依那西普和糖蛋白RNase B的N-聚糖。

在Genovis的PNGaseF去除N-聚糖并用SialEXO和GalactEXO截断O-聚糖后，在质谱图中观察到几个与GalNAcs相关的峰。为了去除剩余的GalNAc残基，应用GalNAcEXO酶。用GalNAcEXO处理后观察到的单个蛋白峰显示完全去除剩余的GalNAcs。 GalNAcEXO在生理缓冲液和中性pH值中具有活性，使其与大多数样品相容。此外，GalNAcEXO的活性不依赖于任何可能影响LC-MS分析的辅因子，如BSA。根据底物的性质，糖蛋白的GalNAcEXO反应在2小时内完成，而更复杂的样品可能需要孵育过夜。Genovis的GalNAcEXO也可固定在离心柱中，以便快速方便地处理样品，在制备过程中不会残留酶。与丝氨酸或苏氨酸连接的 GalNAc（称为 Tn 抗原）被 GalNAcEXO 快速有效地水解。吉林PNGaseF去糖基化酶疾病机理研究

用SialEXO处理血清，上样于GlycOCATCH，洗涤，洗脱O-糖基化蛋白。Swiss Prot 数据库鉴定蛋白质列表。天津N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶疾病机理研究

Genovis的SialEXO固定化用于复杂糖蛋白的去唾液酸化：在设置反应条件时，需要在所需的反应时间和完成反应所需的酶量之间进行权衡。较高的酶量可保证在更短的时间内完成周转，但会使下游分析复杂化。为了避免此类问题，我们以离心柱形式固定了活性SialEXO。这允许以更短的孵育时间孵育具有明显更高量的唾液酸酶的糖蛋白底物。Genovis测试了 SialEXO 冻干和 SialEXO 固定化在人 C1 抑制剂上的性能。这种糖蛋白是一种具有挑战性的底物，具有 6 个 N- 和多达 26 个 O-聚糖，由 α2,3 和 α2,6 连接的唾液酸修饰。对游离的N-聚糖的分析表明，SialEXO在溶液中完全脱唾液酸化，SialEXO固定化。天津N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶疾病机理研究