流式细胞技术是细胞和小颗粒定性和定量表征的有效方法,其用于外泌体定量检测的准确性也在不断上升。将外泌体表面特异性标志物CD63、CD81等相应抗体进行标记,可用流式细胞仪检测到阳性表达,从而实现对外泌体的定量。但流式细胞技术检测时需要单颗粒悬浮液,当外泌体浓度高或分离过程中发生外泌体囊泡聚集时将导致一次观察到多个颗粒,从而导致数据不准确。因此,为了通过流式细胞仪观察,需要将外泌体通过免疫捕获或共价结合固定在磁珠表面上,从而便于将外泌体囊泡暴露于已知或者预期在外泌体表面表达的抗原的荧光偶联抗体中。在流式细胞术之前,可以在落射荧光显微镜(EPI)下观察与磁珠和荧光抗体偶联的外泌体囊泡。当样品通过流式细胞仪时采集荧光信号,不只可以对外泌体进行高通量分析,还可以基于抗原表达对外泌体进行定量或分类。尚未完全发现调节外泌体细胞结合的途径。成都外泌体示踪
被特定部位的细胞获取的瘤子外泌体可为肿细胞的转移准备转移前微环境。用肺转倾向的肿细胞细胞来源的外泌体处理小鼠后可使骨转倾向的肿细胞细胞重新定向。外泌体的蛋白质组学分析发现不同部位倾向性的肿细胞细胞来源的外泌体具有不同的整合素(integrin)表达谱,整合素α6β4和α6β1与肺转有关,而整合素αvβ5与肝转有关。敲低整合素α6β4和αvβ5可减少外泌体被靶部位细胞获取,进而分别降低了肺和肝的转移。进一步研究发现外泌体整合素被细胞获取后活跃了Src的磷酸化和促炎的S100基因的表达。通过临床数据分析显示外泌体整合素可作为预测肿细胞转移的部位倾向性的诊断指标。外泌体的提取的方式:PS亲和法。上海血液外泌体外泌体可以作为“天然的纳米粒子”来进行药物递送。
外泌体分离的主要挑战之一是消除纳米级污染物,包括干扰外泌体标志物解析的游离核酸和脂蛋白。超速离心是目前分离外泌体的主要技术。尽管如此,它仍难以符合临床应用所需的标准,主要是由于该方法得到的外泌体纯度不足,产量较低,完整性欠佳且分离纯化操作耗时长。其他方法,例如基于聚乙二醇(PEG)的沉淀,磷脂酰丝氨酸亲和捕获,尺寸排阻色谱法和膜亲和捕获,近年来已经出现在特定的应用中,但是只适用于特定场景。近来,非对称流场-流分离方法已被用于从细胞和瘤子培养基中高分辨率地分选EV亚群,但其通量受到繁琐的样品制备程序的影响。单一分析耗时的过程也限制了其普遍的应用。因此,目前亟需开发创新技术以提高外泌体分离纯化的效率,纯度,产量,速度和耐用性。基于超滤的技术提供了潜在的有前途的替代方法,但它们也有缺点。在切向流过滤中,使进料流平行于多孔膜流动,以避免堵塞。然而,尽管已实现使用切向流过滤从大量条件细胞培养基中浓缩外泌体,但受制于其一次性模块的成本高,高剪切应力,难以处理小体积样品等因素而难以应用于临床分析。
外泌体的提取分离方法:1、超速离心法(差速离心):超离法是较常用的外泌体纯化手段,采用低速离心、高速离心交替进行,可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单,获得的囊泡数量较多而广受欢迎,但过程比较费时,且回收率不稳定(可能与转子类型有关),纯度也受到质疑;此外,重复离心操作还有可能对囊泡造成损害,从而降低其质量。2、密度梯度离心:在超速离心力作用下,使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层,是一种区带分离法。通过密度梯度离心,样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围富集。此法获得的外泌体纯度较高,但步骤繁琐,耗时。利用外泌体自身的物理化学性质所研发的各种市售的外泌体分离提取试剂盒也能达到分离效果。
质膜的连续内陷较终导致多泡体的形成,多泡体可与细胞内的其他囊泡和细胞器交叉,从而增加了外泌体成分的多样性。根据细胞来源的不同,细胞外囊泡,包括外泌体,可以包含细胞的许多成分,包括DNA、RNA、脂质、代谢物、胞质和细胞表面蛋白。目前产生外泌体的生理目的尚不清楚,需要进一步研究。一个推测的作用是外泌体可能从细胞中去除多余和/或不必要的成分以维持细胞内环境的稳定。较近的研究也表明外泌体中特定细胞成分的功能、靶向、机制驱动的积累,提示它们在调节细胞间通讯中发挥作用。对外泌体的分析和检测可以辅助疾病的早期诊断、疗效评价和预后分析。植物提取试剂盒报价
外泌体的提取的方式:密度梯度离心法。成都外泌体示踪
外泌体的生物发生和鉴定。液体和细胞外成分,如蛋白质、脂类、代谢物、小分子和离子,可以通过内吞作用和质膜内陷,与细胞表面蛋白一起进入细胞。由此产生的胞腔侧质膜芽的形成表现为质膜的外-内取向。这一出芽过程导致芽的形成可能与内质网(ER)、跨高尔基网络(TGN)和线粒体预先形成的早期核内体融合。ESEs也可以与ER和TGN融合,这可能解释了内吞物如何到达它们的。因此,一些ESEs可以包含膜和腔的成分,可以表示不同的起源。外泌体表面蛋白包括四聚体蛋白、整合蛋白、免疫调节蛋白等。外泌体可以包含不同类型的细胞表面蛋白、细胞内蛋白、RNA、DNA、氨基酸和代谢物。成都外泌体示踪
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