CK19免疫荧光IF

细胞免疫荧光实验注意事项：根据所检测抗原所在位置来确认是否需要加入 Triton 进行通透。若所检测抗原表位位于膜蛋白的白外段，则不需要通透；一般 5% BSA 封闭即可达到效果；从加荧光二抗起，后面所有操作步骤尽量避光。缩短在荧光显微镜下的观察时间，1~2 h 为宜。染色后尽快荧光显微镜下观察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。无/弱染色：烤片温度过高，推荐 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否适用固定液和石蜡切片，使用浓度是否过低，孵育是否时间过短等。免疫荧光技术是基于免疫学、生物化学和显微镜技术的重要方法之一。CK19免疫荧光IF

免疫荧光通透（目的是使抗体进入胞内），0.5%TritonX-100(一种去垢剂，用PBS配制)室温通透20min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）；除了TritonX-100，也可作为通透剂，并且固定后的样品不需要通透。封闭（减少一抗和二抗与非特异位点进行结合），通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min。常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。醛类固定的样品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封闭液进行封闭。BGLAP/OCN免疫荧光染色免疫荧光技术是一种利用荧光物质标记抗体来定位抗原的技术。

免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。在此基础上又分为两种方法：直接法和间接法。直接法：将标记的特异性荧光抗体直接加到抗原上，经过一定时间反应，即可结合并显色。间接法：先用抗原的抗体（一抗）与抗原反应结合，再用荧光标记的二抗（一抗的抗体）与抗原反应，形成抗体-抗原-抗体复合物。

免疫荧光应用范围：其应用范围极其普遍，可以测定内分泌、蛋白质、细胞因子、细胞表面抗原、多肽、核酸、受体、神经递质、肉瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、药物检测、免疫学、血型鉴定等。免疫荧光实验步骤：洗涤：PBS洗涤5min*3次。封闭：使用封闭液对样本进行封闭，一般1h。加一抗：使用合适浓度的一抗与样本4℃过夜。洗涤：PBS或PBST洗涤5min*3次。加二抗：使用间接法时需要加二抗处理，根据说明书使用合适的浓度，避光处理1h（后面步骤均需避光）。洗涤：PBS或PBST洗涤5min*3次。封片：滴一滴防淬灭剂，封片。可立即观察后暂存4℃尽快观察。免疫荧光技术可以用于研究遗传疾病和基因表达调控。

荧光的产生：一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。免疫荧光在医学诊断中起着重要作用，可以用于检测病原体、肉瘤标志物等。CK19免疫荧光IF

荧光抗原法是利用已知的荧光标记物来追踪或检查相应抗体的方法。CK19免疫荧光IF

细胞的固定及免疫荧光：吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向孔内滴加足够量适宜浓度的二抗，37℃，室温避光孵育1小时。注意二抗带有荧光素标记，因此操作过程尽量在暗处进行。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst复染细胞核，一般为蓝色荧光；避光孵育5-10min。使用PBS轻洗细胞3 次，每次 5 min，洗去多余的DAPI。取爬片时由于爬片与培养皿底结合较紧，张力较大，可将注射器针头针尖向背面做个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出即可。用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，注意将爬片反过来贴于多聚赖氨酸载玻片上，然后在荧光显微镜下观察并采集图像，注意选择抗体对应的激发光源。CK19免疫荧光IF