细胞免疫荧光实验注意事项:根据所检测抗原所在位置来确认是否需要加入 Triton 进行通透。若所检测抗原表位位于膜蛋白的白外段,则不需要通透;一般 5% BSA 封闭即可达到效果;从加荧光二抗起,后面所有操作步骤尽量避光。缩短在荧光显微镜下的观察时间,1~2 h 为宜。染色后尽快荧光显微镜下观察,若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。无/弱染色:烤片温度过高,推荐 56~60 ℃ 1~2 h;一抗是否适用固定液和石蜡切片,使用浓度是否过低,孵育是否时间过短等。荧光抗体法和荧光抗原法都属于免疫荧光技术的范畴。S100 beta免疫抗体
荧光的产生:一此化学物质能从外界吸收并储存能量(如光能、化学能等)而进入激发态,当其从激发态再回复到基态时,过剩的能量可以电磁辐射的形式放射(即发光)。荧光发射的特点是:可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光;而一旦停止供能,发光(荧光)现象也随之在瞬间内消失。可以引起发荧光的能量种类很多,由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光,由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。CK14免疫检测免疫荧光技术在生物学研究、医学诊断和药物开发等领域具有普遍应用。
免疫荧光应用范围:其应用范围极其普遍,可以测定内分泌、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肉瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别,又可分为传染性疾病、内分泌、药物检测、免疫学、血型鉴定等。许多物质都可产生荧光现象,但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。异硫氰酸荧光素为黄色或橙黄色结晶粉末,易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4,较大吸收光波长为490495nm,较大发射光波长520530nm,呈现明亮的黄绿色荧光。
免疫荧光注意事项:对照实验的设置:1、内源性组织背景对照:某些细胞和组织可能有固有的生物学性质,会产生背景荧光,对结果产生影响,例如色素脂褐质。因此在孵育一抗前,应对样品进行观察,确保抗原本身没有信号。2、阳性对照:用确认含有待测抗原的组织或细胞,与待测标本进行统一处理,结果应为阳性,可证明待测抗原有一定活性并且实验过程中用的试剂及方法均可靠。3、阴性对照:与阳性对照相反,用明确不含有待测抗原的细胞或组织切片染色,结果若为阴性,可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性结果。早期的免疫荧光技术是将抗体与示踪物质结合,用于定位组织或细胞内的抗原物质。
细胞免疫荧光实验常见问题:1、信号弱或者无信号:细胞或组织样本保存时间过长;2)抗体浓度不合适,参照抗体说明书的稀释浓度,再根据样本表达量进行摸索;3)一抗孵育时间不合适,建议 4 ℃ 过夜孵育。2、高背景:封闭不充分;抗体浓度过高;抗体孵育时间过长或温度过高;清洗不充分;样本变干,染色过程确保样品始终浸没于液体环境中.3、非特异性染色较多:固定液残留,这里需要缩短固定时间并且在封闭液中加甘氨酸,并且抗原修复也可以帮助解决非特异性染色;二抗残留,二抗需要用带有吐温 20 的 PBS 溶解,只要荧光显微镜的强度还可以增大,那么就可以增加吐温洗脱掉非特异性染色。免疫荧光技术是一种利用荧光物质标记抗体来定位抗原的技术。CK14免疫检测
免疫荧光技术中,以荧光物质标记抗体来定位抗原物质的方法被称为荧光抗体技术。S100 beta免疫抗体
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