国内激光荧光双光子显微镜荧光寿命计数

首先我们来简单介绍一下激光扫描共聚焦和双光子这两种当红的显微成像技术。激光扫描共聚焦显微技术，是荧光显微成像的一种，用于激发样品的荧光信号并对其放大成像。在激光扫描共聚焦显微镜中，样品焦平面上每一时刻只有一个点被激发光照射，纵然焦平面外也有激发光照射，但通过探测器前的（pinhole），有焦平面上的荧光信号能被探测器接收。也就是说，每个时刻，只有焦平面上一个点的信号被探测。通过点扫描的方式，一个个点的信号就可以组合出终的图像。双光子显微镜（包括多光子显微镜）同样采用点扫描的方式得到图像。不同的是，其采用的激发光波长较长，只有当两个（或更多）激发光光子几乎同时轰击荧光探针的时候才可能激发出荧光信号。所以只有在光子密度特别大的焦点，出才会激发出荧光。也就是说，双光子显微镜中，同样每个时刻只有焦平面上一个点的信号被探测，并且连焦平面外的荧光信号也不会有。如果已经有了飞秒光，就可以几套双光子显微镜共享一台，只需分光即可。国内激光荧光双光子显微镜荧光寿命计数

Denk很快就将双光子显微镜用于神经元成像，而1997年在Svoboda测量完整老鼠大脑的锥体神经元的感官刺激诱导树突钙离子动态后，双光子显微镜的潜能开始完全凸显。值得一提的是，霍华德·休斯医学院Svoboda实验室和Thorlabs在2016年合作推出了一种强大的多光子介观显微镜，其成像视场达到5毫米，能够跨多个脑区进行高速功能成像。根据清华大学单一采购来源的**指导意见：这种显微镜的视场是普通双光子显微镜的10倍。30年来，双光子显微镜已成为较厚生物组织三维成像中不可或缺的工具。从双光子到三光子甚至四光子，这种非线性成像技术通常也被统称为多光子显微镜。下图统计了自1990年以来每年发表的多光子显微镜文章数量，发展速度可见一斑。美国荧光激光双光子显微镜联系方式双光子显微镜是新型的荧光显微镜，其原理大致是这样的；

实验从理论和实验上评估了多焦点v2PE显微镜的空间分辨率，并与单光子荧光显微镜进行了对比，实验中v2PE的激发波长为521 nm，使用放大倍率为100倍的物镜，尺寸为0.6AU，对直径100nm的荧光颗粒进行了测试性成像，共获得40幅不同采样深度的图像合成为三维图像。图像在横向和纵向的半高全宽分别是177 nm和297 nm，这些值接近显微镜的理论分辨率。后续还利用软件模拟从理论上研究了多焦点v2PE显微技术的空间分辨率，模拟计算显示v2PE点扩散函数(PSF)的横向半高宽与单光子激发荧光(1PE)相似，轴向的半高宽较1PE减少，可以提高空间分辨率。

双光子显微成像技术不是什么新技术，早在20多年前就有了，目前已经在生命科学和材料科学中广泛应用。几年前双光子**过期后，已经推出自己的双光子显微镜的厂家估计不少于10家以上。即便如此，世界上很多实验室都搭双光子，自己搭的好处有很多，首先是便宜，尤其是实验室已经有飞秒激光器，那就更很省钱了。其次是灵活，可以选择针对特殊用途的搭配，改动也灵活。结束后的好处就是可以锻炼队伍，一趟走下来可以把新手带出来，后期维护也更加自由。当然坏处也不少，首先是操心，特别是第1次搭的时候，开始要想方案，后来要解决各种实际问题。其次是花时间，加上买配件的时间，比买一台现成的商业化双光子耗时长。现在已经有不少关于如何搭双光子显微镜的文章，各种protocol，大多是老外写的，中文的较少。其实完全自己搭一套好用的系统还是不容易的，尤其是没有经验的时候，容易走弯路，多花钱，也多花时间，再加上双光子的重要器件都需要从国外购买，在国内买这些东西耗时较长。因此，我想总结一下我们的经验，贴出来分享，希望能帮到想自己动手的实验室双光子显微镜有哪些应用呢？

配合双光子激发技术，激光共聚扫描显微镜则能更好得发挥功效。那么，什么是双光子激发技术呢？在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子使电子跃迁到较高能级，经过一个很短的时间后，电子再跃迁回低能级同时放出一个波长为长波长一半的光子（P=h/λ）。利用这个原理，便诞生了双光子激发技术。双光子显微镜使用长波长脉冲激光，通过物镜汇聚，由于双光子激发需要很高的光子密度，而物镜焦点处的光子密度是比较高的，所以只有在焦点处才能发生双光子激发，产生荧光，该点产生的荧光再穿过物镜，被光探头接收，从而达到逐点扫描的效果。双光子显微镜的性能得到不断地优化，结合它的特点，大致可以分成深和活两个方面的提升。国外ultima双光子显微镜成像视野

显微成像技术包含：双光子显微镜、宽场荧光显微镜、共聚焦显微镜、全内反射荧光显微镜等多种成像方式。国内激光荧光双光子显微镜荧光寿命计数

光学显微镜和电子显微镜本质的区别在于，光学显微镜：用的是可见光电子显微镜：用的是高频电子射波有什么区别，在于一个基本的原理，光的衍射。。。光波是一个有趣的东西，其中有一项，如果物体的体积小于光的波长，光一般可以绕过去，不发生明显变化。也就是说，有这个物体和没这个物体，在这种情况下，光是不会发生明显改变的。可见光的波长（肉眼）：380～780纳米，也就是，如果比380纳米还要小的东西，用光学显微镜，无论你放大多少倍，也是看不见的。因为光绕过去了。。。光的衍射为了克服这个问题，科学家用波长更短的光去照射物体，也是就被观测物。比如10纳米级的光，这样，就能看到我们用肉眼无论如何都看不见的东西。这就是电子显微镜多说一句，光速是不变的。光速=频率×波长。波长越短，频率越大。。频率越大，光波的能量越大。这就是为什么电子显微镜的功率越大，能看到的东西越小。颜色取决于物体能反射光的波长的长短当你看到的物体小于较小可见光的波长，那它就是没有颜色的。。。因为颜色是肉眼对于可见光频率在大脑中的投影。。。。所以只能把他们统一变为黑白。。。没有颜色不是透明的意思，它们不是肉眼可见颜色的定义中包含的。国内激光荧光双光子显微镜荧光寿命计数

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